[发明专利]一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种环境污染物生物探测器的生产方法，具体涉及一种灵敏监测环境污染物浓度的转基因斑马鱼的构建方法。

背景技术

随着社会的发展，人类生产和利用的合成化学物质越来越多，这些物质通过各种途径进入环境中，不仅会引起水生生物死亡和水生态系统破坏，还会直接或间接威胁到人类健康。据世界卫生组织估计，重金属、多环芳烃及多氯联苯等化学污染物导致世界每年大约数百万人死亡，更是60～90％癌症的诱因。仅在中国，每年因工业污染物引发的新增癌症患者数量就高达94.5万。然而，当今社会已无法离开化学工业及其产品，为此，通过加强对环境中污染物水平的检测，进而限制工厂污染物排放就变得更为紧迫。

作为一种来自印度的热带淡水鱼，斑马鱼最初被用于发育生物学与遗传学的研究。由于其具有自身的独特优势，如：体型小、体外受精、卵生且产卵量大、胚胎透明且发育速度快，此外其培养液中可直接加入化学污染物，进而检测污染物毒性。因此，斑马鱼也逐渐被应用于环境毒理学研究中，而欧盟、美国及日本各国更是将斑马鱼列入环境保护标准测试生物中。

与此同时，根据污染物作用于斑马鱼后的生物学指标变化，结合绿色荧光蛋白(GFP)及红色荧光蛋白等转基因技术，研究者还构建了各种转基因斑马鱼模型使其可用于定量反映环境污染物浓度。如根据多环芳烃对于细胞色素酶(CYP)1A1的诱导作用，Hung等人构建了表达绿色荧光蛋白(CYP-GFP)的转基因斑马鱼，可在0.04μg/L多氯化三联苯的诱导下表达绿色荧光，提示环境中多环芳烃的含量超标(Hung K.W.，Suen M.F.，Chen Y.F.，Cai H.B.，Mo Z.X.，Yung K.K.；Detection of water toxicity using cytochrome P450transgenic zebrafish as live biosensor：for polychlorinated biphenyls toxicity；Biosens Bioelectron，2012，31(1)，548-553)。复旦大学宋后燕、钟涛领衔的课题组则筛选出对雌激素类物质敏感的斑马鱼vtg基因启动子，据此构建了随vtg表达绿色荧光蛋白进而可直观监测环境中雌激素含量的转基因斑马鱼，响应浓度可达到μg/L级(Chen H.，Hu J.，Yang J.，Wang Y.，Xu H.，Jiang Q.，Gong Y.，Gu Y.，Song H.，Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens.Aquat Toxicol，2010，96(1)，53-61)。与传统环境检测方法相比，转基因斑马鱼模型具有快捷方便且经济有效等优势，但目前已有的监测模型往往仅能针对特定化学污染物进行反应，缺乏广谱性。

作为机体抵御外源物摄入的主要工具之一，Mdr1等ABC转运蛋白被发现高表达于受精24h后的斑马鱼中，可显著降低重金属毒素、多环芳烃和多氯联苯等多种毒素的积累及其毒性(Faria M.，Navarro A.，Luckenbach T.，Pina B.，Barata C.，Characterization of the multixenobiotic resistance (MXR)mechanism in embryos and larvae of the zebra mussel(Dfeissena polymorpha)and studies on its role in tolerance to single and mixture combinations of toxicants.AquatToxicol，2011，101(1)，78-87)。此外，我们的实验结果及文献(He Q.，Liu K.，Wang S.，Hou H.，Yuan Y.，Wang X.，Toxicity induced by emodin on zebrafish embryos.Drug Chem Toxicol，2012，35(2)，149-154)均表明，Mdr1可在毒素存在的情况下被诱导表达，从而提示可针对性地开发新的环境监测型斑马鱼。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测环境污染物的转基因斑马鱼的制备方法，该转基因斑马鱼可方便快捷地对多种化学污染物浓度进行监测，为水环境保护工作提供新的工具。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：