[发明专利]一种表达低过敏性花生过敏原的乳酸乳球菌重组菌及其应用

说明书

【技术领域】

本发明涉及表达低过敏性花生过敏原mArah2的重组乳酸乳球菌菌株，其构建方法及应用，属于生物工程技术领域。

【背景技术】

花生过敏是最常见的食物过敏反应，发病率较高，会引起严重甚至致命的临床症状。花生过敏通常是终生的，一般不易随着年龄增长产生免疫耐受。目前，特异性免疫疗法是较为有效的花生过敏治疗方法。但传统的特异性免疫疗法大都使用过敏原粗提物，提取量小、纯度低。利用基因工程方法重组表达过敏原蛋白是一种简便可行的方法。陶爱林等在专利《一种重组花生过敏原与突变体及其制备方法和应用》中利用大肠杆菌作为表达宿主成功制备一种重组花生过敏原与突变体。但大肠杆菌产内毒素，其表达产物需后续纯化，都阻碍了大肠杆菌表达系统的大规模推广及应用。

乳酸乳球菌已被广泛用于食品、医药和农业等领域，是公认安全的食品级微生物。近年来，乳酸乳球菌分子遗传学研究的重大发展使得利用乳酸乳球菌表达外源抗原制备粘膜疫苗成为研究的热点。乳酸乳球菌表达的蛋白可直接连同菌体一起口服，同时其表达的外源蛋白可诱导机体产生有效的免疫应答。

花生过敏原包括分子量介于0.7-100kDa间的多种糖基化蛋白，Arah2是花生中致敏性最强的组分之一，可被超过90%的花生过敏患者血清中特异性IgE识别。Stanley J S、Chatel J M等人的研究结果表明，Arah2的主要线性抗原表位为：aa9-18、aa39-48、aa47-56及aa61-66（StanleyJS，etal.Identification and mutational analysis of the immunodominant IgE binding epitopes of the major peanut allergen Arah2.Arch Biochem Biophys,1997,342(2):244-253;Chatel J M,et al.Isolation and characterization of two complete Arah2 isoforms cDNA.Int arch Allergy Immy,2003,131(1):14-18）。其中，第一个IgE结合表位aa9-18与CD4⁺T细胞结合表位有重合（Prickett S R et al.Arah2 peptides containing dominant CD4⁺T-cell epitopes:candidates for a peanut allergy therapeutic.J Allergy Clin Immun,2011,127(3):608-615）。考虑到天然过敏原在免疫治疗中可能诱发过敏反应，本发明通过基因工程技术对优化后花生过敏原基因nArah2进行合理的修饰突变，在保留其免疫原性的同时降低其过敏原性，获得了低过敏原性的过敏原基因mArah2。

因此，本发明利用乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）作为宿主菌株表达mArah2蛋白，以制备花生过敏口服疫苗，并通过小鼠模型评价其免疫效果。

【发明内容】

本发明要解决的技术问题是提供一种低过敏原性的花生过敏原蛋白mArah2，包含该蛋白编码基因的重组质粒，用该质粒转化乳酸乳球菌菌株，其中所述菌株可以是乳酸乳球菌NZ9000，得到重组乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH。

本发明还涉及包含所述的重组乳酸乳球菌菌株的疫苗，所述疫苗可以是口服制剂，例如胶囊剂、锭剂、粉剂或颗粒剂等。

本发明还涉及所述的重组质粒或重组乳酸乳球菌菌株在制备可用于治疗花生过敏的乳酸乳球菌疫苗中的用途。

本发明中低过敏原性的花生过敏原蛋白mArah2在保留原始蛋白免疫原性的基础上降低了其过敏原性，可有效避免在免疫治疗中天然过敏原可能诱发的过敏反应，大大降低副作用。并且通过动物实验结果表明，低过敏原性的乳酸乳球菌重组菌株可促使免疫反应从Th2型向Th1型转变，对花生过敏起到预防作用。

因此，mArah2基因可以重组质粒疫苗的形式用于防治花生过敏；重组乳酸乳球菌菌株L.lactis NZMH可作为一种新型的低致敏性疫苗应用于花生过敏的临床预防及免疫治疗。