[发明专利]一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，属于分子细胞遗传学领域。

技术背景

绘制各类真核生物的表观基因组图谱的工作正在进行，这通常包括各种修饰的组蛋白、非组蛋白或DNA甲基化在基因组上的分布，并将这些修饰与基因组功能相联系。表观基因组的全基因组分析可以在分子水平上通过染色质免疫沉淀偶联DNA测序技术(Chromatin immunoprecitation-sequencing， ChIP-seq)或结合DNA微阵列技术(ChIP-chip)得到揭示。但真核生物基因组中含有大量的重复序列会阻碍基因组测序分析，并且这种技术不能辨别处在细胞周期不同阶段的细胞，这样获得的数据代表一些基因不同表达模式的细胞群体或处于不同细胞周期的细胞群体所产生的平均值。这种细胞间的异质性必然会限制关联染色质功能与组蛋白修饰的精确性，而且这些技术只能应用于已经测序或者已经有芯片开发的物种。

现在这些问题可通过免疫染色技术来检测单细胞水平的表观修饰的分布情况来解决。在有丝分裂中期很少或几乎没有转录，这样消除了细胞间的差异性，细胞间的免疫标记一致性也可以重复分析。免疫中期染色体能在单细胞中分析整个表观基因组，包括难以用基于测序方法达到的重复序列富集的区域，并且结合4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色/荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术能识别单个染色体/某些染色质区域的表观修饰情况。尽管染色体显微技术比Chip-seq技术的分子分辨率低，但是它将提供一种有价值的表观图谱的补充方法和途径，两者相互补充。用表观修饰抗体进行的中期染色体免疫标记能够在显微镜下观察和研究亚细胞核结构和染色体水平的表观修饰分布，这也被称为表观基因组核型(Genome Biol. 2010，11，R110)。

植物染色体由于与动物染色体结构的差异，植物中一些显带技术并没有产生很好的带型，一些紧密相邻的多条荧光带不能分辨出来。因此，用表观修饰的抗体进行免疫标记时只能观察到大致的分布趋势，并没有像动物中呈现出带纹。借助计算机进行的图像处理与分析技术的发展，尤其是反卷积图像复原技术为我们完善显带技术并在植物中获得清晰的带纹提供了机会(Chromosoma 2004，113,16)。图像模糊是由于光学显微系统中点扩散函数(point spread function，PSF)造成的，反卷积图像复原技术是以这个概念为基础，运用反卷积算法，对所得到的比较模糊的图像进行复原，能够显著提高宽场荧光显微镜所得图像的分辨率。因此如果能将反卷积图像复原技术运用于植物中期染色体表观基因组核型分析中，可以清晰地得到植物中表观修饰标记的信号模式以及染色质结构和功能。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，该方法能够显著提高宽场荧光显微镜所得图像的分辨率，在植物中期染色体中获得清晰的带纹，本方法操作简单、方便易行。

本发明提供的植物中期染色体表观基因组核型的分析方法，包括如下步骤：

制备植物中期染色体；使用不同的表观修饰抗体，进行传统的免疫染色实验；拍照，图像处理；然后进行荧光原位杂交实验，利用不同的探针进行染色体的识别。

所述免疫染色实验拍照以及图像处理具体包括如下步骤：首先通过测量染色体的高度，设置步长，通过控制Z轴步进器，对染色体逐层扫描，采集到一组二维图像，用Metamorph软件的No Neighbors deconvolution程序，对这组图像进行反卷积处理，去模糊复原，接着用Meta morph软件的3D Reconstruction，对这些复原的图像沿Z轴进行三维重建，这样更反映了染色体表观带纹的真实形态。显微镜镜头的点扩散函数通常由激发光波长、镜头数值孔径、图像像素距离、介质折射率等决定。其中，图像像素距离和介质折射率是显微镜中固定的数值。一般Olympus 100×镜头数值孔径为1.35，然后根据样品中所用的荧光染料的激发光波长来进行设置，处理DAPI染色形成的图像时激发光波长设为488 nm，FITC的为520 nm。然后再根据染色体的厚度，染色的深浅，信号的强弱，曝光时间的长短等其他因素来进一步调整程序中的一些参数，进行反卷积处理。

本发明与现有技术相比具有以下有益效果：