[发明专利]一种用于扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种用于扩增红球菌的PCR引物及检测红球菌的方法及试剂盒。

背景技术

红球菌属细菌属于放线菌目棒杆菌亚目诺卡氏菌科，是一类好氧，不产生孢子的革兰氏阳性菌，少数可能致病。红球菌属中的主要成员包括：嗜粪红球菌、马红球菌、滕黄红球菌、红平红球菌等。红球菌具有一个相对快速和简单的生长周期，可作为实验系统进行科学研究。大多数红球菌能在广泛的环境中生长，比如沙漠，水体等。

红球菌具有重要的应用价值，其重要作用是进行生物转化。红球菌能利用自身的生物系统将原料进行生物转化，如利用很多有机物生成类固醇、丙烯酰胺和丙烯酸等。另外红球菌能降解及利用一些环境污染物及有机物如烷烃，代谢有害的环境污染物，例如甲苯、萘等，并且与化石燃料的生物脱硫作用有关。同时它的一些种对人、动物或植物都有影响。因此，红球菌越来越为人们所关注。

现有技术中，有如下两种常用的对红球菌进行鉴定的方法：

1、生理生化指标鉴定。此方法是目前许多生化实验室常用的方法，此方法需要得到菌株的纯培养物，且实验周期长，实验结果受人为观察影响因素较大，准确性不高。

2、提取菌株DNA进行测序。目前是用16SrRNA基因引物进行PCR扩增，将扩增出的DNA片段进行测序。此方法结果比较准确。但仍需要得到菌株的纯培养物，无法从混合样品中快速鉴定是否含有红球菌。

因此本领域迫切需要开发出一种能够快速、准确判定红球菌的方法。

发明内容

本发明针对现有技术鉴定红球菌试验周期长、适用范围窄的不足，提供一种能够快速、准确、方便，可对混合样品如土壤、海底沉积物、水中是否含有红球菌进行快速判定的方法。

为实现上述目的，本申请的发明人设计了一对针对红球菌16SrDNA基因部分片段的PCR引物，Rho-F：5’-GGGTCTAATACCGGATAKGACC-3’（序列如SEQ ID No.1所示），Rho-R：5’-CCCGTATCGCCTGCAAGC-3’（序列如SEQ ID No.2所示）。16S rDNA基因是指基因组中编码16S核糖体RNA（rRNA）分子的对应DNA序列，也就是编码16S rRNA的基因。

本发明的术语“引物”指作为合成引物延伸产物的起始位点的单链寡核苷酸序列，其与待复制的核酸链互补，长度和序列必须适合于延伸产物的合成。引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

本发明提供一种检测红球菌的试剂盒，包含用于扩增的PCR引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ IDNo.2所示。作为优选，所述PCR引物为荧光定量PCR引物。

本发明还提供一种检测红球菌的方法，包含以下步骤：

步骤1：配制PCR反应体系，94℃预变性10分钟进行30个PCR循环，循环完毕后72℃延伸10分钟；所述PCR反应体系中上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示；

步骤2：检测扩增结果并进行测序比对。

作为优选，步骤1所述PCR循环参数为：94℃变性1min、58℃复性1min、72℃延伸1min。

作为优选，步骤1中所述PCR反应体系为：

其中，样品DNA浓度为10-200ng/μL，上游引物及下游引物浓度为10-20pmol/μL。

更优选地，步骤2所述检测为琼脂糖电泳检测450bp的条带出现。

更优选地，所述PCR为荧光定量PCR。

本发明与现有的技术相比具有如下有益效果：

1.本发明所述红球菌检测方法，操作简单，耗时少，结果更精确。

2.本发明所述引物目标位于16S rDNA基因，该基因在进化中较为保守，是分类学研究中常用的研究对象，具有较好的特异性。

3.本发明所述方法检测周期短，在3小时内得出结果、适用范围广，无需分离纯菌株即可对各种环境样品中是否含有红球菌属细菌进行检测。

附图说明

图1为本发明所述引物以混合菌株DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；

图2本发明所述引物以土壤DNA为模板的扩增产物凝胶电泳图；其中泳道1-3分别为不同土壤的DNA样品；