[发明专利]一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物细胞转化领域，更具体地涉及一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。

背景技术

2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D-gluconic acid，2-KGA）是目前国际上大规模生产的有机酸之一，主要用作D-异抗坏血酸（EA）及其盐类（如D-异抗坏血酸钠，EN）的合成前体，而EA和EN作为维生素C的同分异构体，具有很强的抗氧化性，作为一种可代谢抗氧化剂，其防腐效果大大超过维生素C，而价格不到维生素C的二分之一，应用前景十分广泛。目前，EN已作为一种新型的食品抗氧、防腐和保鲜剂广泛应用于肉类、水果、饮料等食品中。2-KGA还具有多种工业用途，如饲料添加剂，洗涤剂的促进剂，水泥增塑剂和摄影显影剂等。

目前，2-KGA的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法(如US3255093)三种。

美国专利US2153311报道了一种利用铬酸和硫酸铁为催化剂的2-KGA的化学合成方法，但此过程反应时间长（12h～3d）、产量低（40%）。美国专利US4620034和US6018034还报道了一种化学合成方法，即利用金属Pt/Pb作为催化剂，在通入O₂的条件下将葡萄糖氧化形成2-KGA。此方法虽然大大缩短了反应的时间，但是底物投料量很低（只有5%左右），而且反应条件控制严苛，生成的产物易降解。

美国专利US4351902公开了一种以葡萄糖为原料，使用吡喃糖-2-氧化酶、葡萄糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶催化的两步氧化反应生产2-KGA的方法。酶法合成中，虽然在较低的底物浓度（50g/L）下即可得到90%以上的转化率，但此方法因为酶的制作成本高，限制了实现规模化生产，而且反应过程中会生成过氧化氢，这对酶活产生不利影响，底物浓度无法提高。

发酵法是指利用微生物发酵过程直接将底物（如葡萄糖）转化成2-KGA。目前2-KGA的工业生产中最广泛采用的方法是发酵法。发酵法生产中，一般通过流加底物，最高的2-KGA生产水平达到7.66g/L/h，底物浓度达到300-400g/L。发酵法具有生产条件温和、易放大、生产成本相对较低等优点。但是，发酵法生产过程仍然存在以下几个方面的问题：（1）发酵周期长，一般需要几十到上百小时；（2）发酵过程放热量大，冷却循环水用量大，能耗高；（3）发酵液组成比较复杂，提取成本较高；（4）废渣产量相对较大，菌丝体过滤困难，活性炭、珍珠岩等物质用量大，副产物给企业带来处理压力。

因此，有必要提供一种更环保、经济、高效的2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，从而解决现有技术中2-酮基-D-葡萄糖酸的化学合成法反应时间长、产量低、反应条件严苛，酶法生产成本高、生成过氧化氢影响酶活，以及发酵法发酵周期长，放热量大，提取成本较高，废渣处理量大的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括以下步骤：A：以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株为菌种制备静息细胞，其中，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株是指过表达葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌，所述葡萄糖酸脱氢酶的基因来源于所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；B：制备含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液，所述转化液中葡萄糖的浓度为200～250g/L，葡萄糖酸的浓度为200～300g/L；C：向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液中加入步骤A中制备的所述静息细胞进行转化，所述静息细胞的加入量为30～60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。

所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是pBBR1MCS5质粒。

所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是tufB启动子。