[发明专利]一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法

权利要求书

1.一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A：以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株为菌种制备静息细胞，其中，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株是指过表达葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌，所述葡萄糖酸脱氢酶的基因来源于所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003，具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

B：制备含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液，所述转化液中葡萄糖的浓度为200～250g/L，葡萄糖酸的浓度为200～300g/L；

C：向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液中加入步骤A中制备的所述静息细胞进行转化，所述静息细胞的加入量为30～60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是pBBR1MCS5质粒。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是tufB启动子。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建包括以下步骤：

以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因组DNA为模板，PCR扩增获得葡萄糖酸脱氢酶的gadh基因片段；

将质粒pBBR1MCS5以SacI、XbaI酶切，然后与同样经过SacI，XbaI酶切的tufB启动子连接，得到重组表达质粒pBBR1MCS5-PtufB；

将所述扩增获得的gadh基因片段以XbaI、BamHI酶切，然后与同样经XbaI、BamHI酶切的pBBR1MCS5-PtufB载体连接，得到重组表达质粒pBBR1MCS5-PtufB-gadh；

将所述重组表达质粒pBBR1MCS5-PtufB-gadh电转化至氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003中，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中，所述静息细胞的制备是将所述菌种通过发酵培养至对数末期，冷冻离心，PBS缓冲液洗涤两次，收集菌体，从而获得去除营养成分的静息细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述转化的温度为28～32℃，时间为20～24h。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转化的温度为30℃。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C还包括在反应过程中用2M NaOH溶液调节反应溶液的pH使其维持在6.0。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化液中葡萄糖的浓度为200g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为60g/L。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化液中葡萄糖酸的浓度为300g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为30g/L。