[发明专利]单核淋巴细胞体内示踪方法

说明书

技术领域

本发明涉及免疫示踪领域，特别是涉及一种单核淋巴细胞体内示踪方法。

背景技术

单核淋巴细胞在机体的免疫反应中具有重要的作用，目前，临床常用免疫状态的检测方法为淋巴细胞介导的细胞毒性试验，该方法为体外实验，无法真实模拟体内免疫环境。由于免疫反应的复杂性，现有的免疫学检测方法均有其局限性。

现有的细胞示踪技术有同位素标记技术、磁标记技术及生物发光标记技术等。各标记技术均有其优缺点，如：同位素标记技术灵敏度高，适于长期示踪，但有一定的放射性污染，检测复杂，并需要特定的检测场所；磁标记技术为假阳性率低、无创的示踪技术，但其检测需要特定的仪器及大小合适的核磁共振线圈；生物发光标记技术前期转染等标记方法复杂，且深部组织信号强度不理想。

具体的示踪方法为从外周血中分离淋巴细胞，进行标记后回输体内，但由于灵长类等大动物血容量较大，回输体内会导致靶细胞过于稀释，难以进行监测，因此无法适用于免疫状态的检测。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种单核淋巴细胞体内示踪方法，能够使荧光染色后的单核淋巴细胞富集于淋巴结中，以便进行免疫示踪。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种单核淋巴细胞体内示踪方法，包括步骤：采集食蟹猴腋窝处的淋巴结；利用密度梯度离心法获取淋巴结中的单核淋巴细胞；将单核淋巴细胞进行荧光染色；将染色后的单核淋巴细胞输注至食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中；再次采集与所述输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结，并对再次采集的淋巴结采用流式细胞仪进行检测。

其中，荧光染色中采用的染料为羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）。

其中，采集食蟹猴腋窝处的淋巴结的步骤包括以下内容。

麻醉食蟹猴：手术前12h禁食，6h禁水，使用氯胺酮15mg/kg进行麻醉；麻醉后将食蟹猴仰卧保定，将其腋窝局部、四肢局部剃毛以暴露手术部位和静脉，所述静脉用于麻醉保定后补液，补液为5％葡萄糖氯化钠，补液注射速度为1mL/min。

麻醉过程中，观察食蟹猴的呼吸状态，当食蟹猴出现呼吸浅慢、角膜反射迟钝，即麻醉适度。

采集淋巴结：以碘伏消毒所述手术部位，医用酒精脱碘；从食蟹猴腋中线剪开一小口，分离浅筋膜，暴露其深层的结缔组织、脂肪组织及淋巴结，取出淋巴结。

第一次麻醉后约60min按照首次麻醉剂量的1／3剂量追加麻醉一次。

其中，利用密度梯度离心法获取淋巴结中的单核淋巴细胞的步骤包括以下内容。

200目不锈钢网研磨淋巴结，并利用磷酸盐缓冲液（PBS）、Hank′s液或RPMI1640制备淋巴细胞悬液；在悬液中加入红细胞裂解液以裂解悬液中的红细胞。

将红细胞裂解后的悬液缓慢加入葡聚糖-泛影葡胺液面上，水平离心2000rpm×20min；其中，葡聚糖-泛影葡胺置于短中管中，用滴管将悬液沿管壁缓慢滴加于葡聚糖-泛影葡胺的液面上，滴加过程中需保持清楚的界面。

离心后，管内分为三层，中层（云雾层）为单核淋巴细胞，吸取离心后云雾层的液体，置于一短中管中，并加入5倍以上体积的磷酸盐缓冲液、Hank′s液或RPMI1640；1500rpm×10min洗涤重悬离心3次，获得单核淋巴细胞。末次离心后，弃上清，重悬单核淋巴细胞。

其中，将单核淋巴细胞进行荧光染色的步骤包括以下内容。

荧光染料CFSE的配置：将500ugCFSE和90uL二甲基亚枫混合以制备10mmol/L的CFSE母液；利用磷酸盐缓冲液将CFSE母液稀释至2umol/L。

取100ml稀释后的CFSE母液与100ml单核淋巴细胞悬液混合染色，获得1umol/L的CFSE荧光单核淋巴细胞悬液，其中，染色孵育温度为37℃，时间为15～20min。

其中，将染色后的单核淋巴细胞输注至食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中的步骤包括：将CFSE荧光单核淋巴细胞悬液输注至食蟹猴掌侧大鱼际下方的结缔组织中；CFSE荧光单核淋巴细胞悬液输注至食蟹猴内的体积为0.5ml。

其中，再次采集与输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结，并对再次采集的淋巴结采用流式细胞仪进行检测的步骤包括以下内容。

输注CFSE荧光单核淋巴细胞后1h、2h、3h、4h分别采集与输注位置同侧的食蟹猴腋窝处的淋巴结；采用步骤利用密度梯度离心法获取所述淋巴结中的单核淋巴细胞的方法获取荧光单核淋巴细胞。