[发明专利]一种固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及固定化酶领域，具体为一种鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas sp.）SC-1菌体中的3-苯氧基苯甲酸降解酶在海藻酸钙包埋作用下制备成固定化酶的方法。

背景技术

拟除虫菊酯类农药是第二大类杀虫剂，目前全世界范围内拟除虫菊酯类农药的施用量占杀虫剂总量的20%左右，施用面积占整个杀虫剂施用面积的25%。该类农药对光、热稳定，自然条件下难迅速降解，长期接触有致畸、致癌、致突变的危害。3-苯氧基苯甲酸(3-PBA) 是大多数拟除虫菊酯类农药的分解产物之一，与拟除虫菊酯类农药相比，在环境中的迁移速率更快，并且3-PBA在土壤中的半衰期长达180d左右，远远长于大多数拟除虫菊酯杀虫剂的半衰期（约30d）。由于自20世纪80年代起拟除虫菊酯类农药的广泛大量施用，3-PBA也越来越多的在水体、土壤、农畜产品及人类尿液中检出。近期研究发现3-PBA是一类潜在的环境激素，其既可以显示抗雄激素活性，也可以与雌激素受体结合显示拟雌激素活性。成年男性体内黄体激素的增加及雌二醇的减少与其尿液中的3-PBA水平有关。此外，3-PBA对微生物的生长具有一定的抑制作用，能阻止拟除虫菊酯类农药的彻底降解，从而使得该类农药难以被生物降解为无毒小分子，因此3-PBA对生态环境和人类健康的潜在危害性较拟除虫菊酯类杀虫剂大。

微生物降解效率高、无二次污染，且可有效降低环境中的有毒污染物。与微生物降解相比，酶降解具有反应效率高、降解速度快、安全无毒副作用等优点，因此酶法降解是治理环境农药污染和消除农产品及食品中农药残留的最直接有效途径之一。近年来对3-PBA的微生物降解研究相对较少，且主要为降解菌筛选及特性方面，而对3-PBA降解酶研究更少，一些学者分离到多株可降解3-PBA的菌株，如Ochrobactrum lupini、Streptomyces aureus、Bacillus sp.、Stenotrophomonas sp.，研究了降解菌株的降解特性及降解途径等，但未进行3-PBA降解酶研究，也未见对3-PBA降解酶进行固定化酶的研究。

鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)SC-1(Genbank 注册序列号为JN857975)，由四川农业大学食品微生物实验室分离保藏，该菌株高效降解3-PBA(以3-PBA为唯一碳源进行生长，在基础盐培养基中，30℃、16 h可将300 μg/mL 3-PBA完全降解)，是目前报道中降解3-PBA能力最强的菌株。本实验室通过对鞘氨醇单胞菌SC-1产3-苯氧基苯甲酸(3-PBA)降解酶的细胞定位分析，表明该降解酶主要位于细胞膜上，是一种膜蛋白，其分子量约为50Ku～90Ku。

固定化技术在保持游离3-苯氧基苯甲酸降解酶的专一、高效的催化活性的同时，更是提高了3-苯氧基苯甲酸降解酶重复利用性、操控性和稳定性的有效手段。酶的固定化效果与载体性质和酶的固定化方法有着较大的关联性。目前常用的酶固定化方法主要包括吸附法、共价结合法、包埋法和交联法等，各有其自身的优缺点，不同种类和性质的酶，往往采用不同的固定化方法。其中的包埋法，可通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现对酶的固定化。该法不改变酶的构象和分子化学变化，反应条件温和，因而回收率较高，对于新发现的酶采用此法固定化具有明显的优势。

发明内容

本发明目的是针对上述问题，提供一种用于环境及农产品中3-苯氧基苯甲酸降解的固定化酶制备方法，该方法制备固定化3-苯氧基苯甲酸降解酶产品的生产工艺简单，材料易得，成本低，酶稳定性较好，使用寿命较长，可重复使用。

为实现上述目的，本发明3-苯氧基苯甲酸降解酶的固定化方法，包括如下步骤：

1）将鞘氨醇单胞菌SC-1发酵液离心（4℃,10000r/min,10min），收集菌体，菌体与0.02mol/L pH值为7的Tris-HCl缓冲液按1:2~1:16（m/v）比例（优选为1:8），混匀；冰水浴条件下超声(40 kHz，45W~450W，工作1s，间歇3s)破碎1200s，离心（4℃,11000r/min,15min）除去胞内酶液，得沉淀A，用Tris-HCl缓冲液重复2次清洗沉淀A，离心（4℃,11000r/min,15min）去除上清，得沉淀B(即细胞碎片)，用0.02mol/LTris-HCl缓冲液重悬沉淀B，恢复至破碎前体积制成3-苯氧基苯甲酸降解酶酶液；