[发明专利]重组马流感病毒毒株、其制备方法及由其制备得到的疫苗

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒株，尤其涉及一种马流感重组病毒、其制备方法及由其制备得到的疫苗。本发明属于生物工程技术领域，

背景技术

马流感(Equine influenza，EI)是由正黏病毒科、流感病毒属的A型流感病毒中的马流感病毒(Equine influenza virus，EIV)引起的马属动物一种严重的常见上呼吸道急性高度接触性传染疾病，多呈暴发性流行，传播非常迅速而且广泛。OIE规定EI为法定报告动物疫病，我国将其列为三类传染病。

目前流行的EI主要为H3N8亚型，然而由于各种压力H3N8亚型EIV也在不断发生变异导致多个谱系病毒的出现，而且EIV已经跨越种间障碍，犬和猪感染EIV事件的发生，使得EI的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来EI频繁暴发，自2003年以来，在英国及其他欧洲国家和美国经常有EI暴发的报道。此外，其他很少发生EI疫情的地区也已受到影响，如2003年至2004年在南非以及2008年在印度也暴发了EI疫情。澳大利亚这样从未发生过EI的国家于2007年也遭受了EI的袭击。

我国大陆地区一直以来都是EI的高发区。自建国以来我国共发生5次EI疫情。2007-2008年，我国暴发了第四次EI疫情，给我国的养马业及即将兴起的赛马业以沉重的打击。疫情首先在新疆暴发，随后蔓延至全国各地。2007年从新疆疫情中分离到一株H3N8亚型EIV，命名为A/equine/Xinjiang/3/07(H3N8)（简称XJ3）。2009年在广西省以及2011年在贵州省也暴发了小规模EI疫情。自1974年我国首次暴发EI以来，除了海南，台湾和福建不曾有文献报道外，我国EI的分布几乎遍及大江南北。

当前疫苗接种是控制EI的效策略。我国曾开展EI疫苗研制工作，但这些疫苗早已不用，一旦EI发生后，主要采取一些对症治疗措施。目前我国所用疫苗都依赖于国外引进，主要是法国Merial公司生产的重组金丝雀活载体疫苗Proteq-Flu1。在2008年北京奥运马术比赛举办之际，为了预防EI，我国不得不从国外引进EI疫苗进行紧急预防接种。对我国分离的H3N8亚型EIV的序列分析表明：我国流行的EIV属于美洲谱系佛罗里达2群，而我国所使用的疫苗Proteq-Flu1所对应的美洲谱系疫苗株属于肯塔基亚谱系，两者比较，在HA基因上有15个位点氨基酸发生了变异，其中有8个分别位于A、B和C抗原区上，这警示我国的EIV正在进行变异，而且实验也证实进口疫苗对我国EI不能够提供完全保护。基于进口疫苗的昂贵价格，以及抗原针对性不强等缺点，开发一种拥有我国自主知识产权、保护性良好的新型高效EI疫苗具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是提供一株重组EIV，其包含EIV XJ3的HA和NA基因、以及流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1)，简称PR8病毒）的6个内部基因。

本发明目的之二是提供一种上述重组EIV的制备方法。

本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

本发明的一株重组马流感病毒（Equine influenza virus），是通过以下方法制备得到的：

（1）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)（简称XJ3病毒）株的HA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒HA基因的重组质粒；

（2）将马流感病毒A/equine/xinjiang/3/07(H3N8)株的NA基因插入到流感基因转录/表达双向载体中，获得含马流感病毒NA基因的重组质粒；

（3）将流感病毒A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)（A/PR/8/34(H1N1)）的六个内部基因PB2、PB1、PA、NP、M和NS分别插入到流感基因转录/表达双向载体中，分别获得含有各基因的重组质粒；

（4）将以上获得的8个重组质粒共转染293T细胞和MDCK细胞共培养细胞单层，转染的细胞经培养后，反复冻融3次，使细胞裂解，释放出病毒粒子，将含有细胞裂解物的培养液离心后，取上清液接种SPF鸡胚，培养2-3天后，取鸡胚尿囊液，检测其血凝活性，获得重组马流感病毒。

在本发明中，优选的，所述的流感基因转录/表达双向载体为pHW2000。