[发明专利]一种检测样品中活菌体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及食品、环境以及生物医药领域，具体地，涉及一种检测样品中活菌体的方法。

背景技术

致病菌（Pathogenic bacteria)能引起疾病的微生物称为病原微生物或致病菌。病原微生物包括细菌、病毒、螺旋体、立克次氏体、衣原体、支原体、真菌及放线菌等。一般所说的致病菌指的是病原微生物中的细菌。细菌的致病性与其毒力、侵入数量及侵入门户有关。虽然绝大多数细菌是无害甚至有益的，但是相当大一部分可以致病。条件致病菌只在特定条件下致病，如有伤口可以允许细菌进入血液，或者免疫力降低时。例如，金黄色葡萄球菌和链球菌也是正常菌群，常可以存在于体表皮肤，鼻腔而不引起疾病，但可以潜在引起皮肤感染，如肺炎（pneumonia），脑膜炎（meningitis）和败血症（sepsis)等。

目前，检测致病菌的方法只能检测样品中的致病菌的总体数量，而不能区分样品中的活菌体和死菌体的数量分别为多少。

发明内容

为了将待测样品中的死菌体和活菌体区别开来，本发明提供了一种检测样品中活菌体的方法，该方法包括：（1）将能够特异地与活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附活菌体；（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；（5）使用针对所述活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的活菌体的含量

通过上述技术方案，本发明能够有效地将待测样品中的死菌体和活菌体区别开来。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“免疫磁球”是指通过偶联反应将抗体结合到磁性微球的表面上，形成的免疫磁性微球。术语“PCR”是指聚合酶链式反应。术语“引物”包括至少一个上游引物和至少一个下游引物。本发明中使用的液体体积均为20℃下的数值。

本发明提供了一种检测样品中活菌体的方法，该方法包括：（1）将能够特异地与活菌体结合的抗体偶联在磁球上，得到免疫磁球；所述能够特异地与活菌体结合的抗体不能与死菌体结合；（2）将免疫磁球与液体形式的待测样品进行混合，得到混合后的物料；混合的条件使得当待测样品中存在活菌体时，免疫磁球能够特异性地吸附活菌体；（3）将所述混合后的物料置于分选磁场中以固定免疫磁球，并洗脱未吸附在免疫磁球上的物质，得到洗脱后的免疫磁球；（4）将吸附在免疫磁球上的物质进行提取DNA的操作，得到模板样品；（5）使用针对所述活菌体的特异性引物对模板样品进行PCR扩增，并根据PCR扩增产物中的目的片段的含量判断待测样品中的活菌体的含量。

其中，获得能够特异地与活菌体结合的抗体的方式可以为：将已通过交叉反应检测而确定能特异地与菌体结合的抗体，进行活菌体中和反应检测，去除能与死菌体结合的抗体，剩余的抗体为不能与死菌体结合但能够特异地与活菌体结合的抗体。

其中，将抗体偶联在磁球上的方法可以按照本领域公知的方法进行，例如按照文献（刘辉荣等，简便高效分离细胞新型免疫磁珠制备，中国公共卫生，2008,11:1349-1351）中的方法进行。

其中，混合的条件可以包括：温度为35-37℃，时间为180min；混合可以在磷酸缓冲液中进行，所述磷酸缓冲液含有0.144-0.162mol/L的磷酸氢二钠和0.038-0.056mol/L的磷酸二氢钠。

其中，作为本发明特别优选的一种实施方式，所述活菌体为大肠杆菌O157（Escherichia coli,O157:H7），所述能够特异地与活菌体结合的抗体为编号为01-95-90的KPL多克隆抗体，该抗体可以从KPL公司商购得到，商品号（Cat.#）为01-95-90。