[发明专利]DC细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地，涉及贴壁单个核细胞、未成熟DC细胞和成熟DC细胞的制备试剂盒和制备方法，以及利用上述方法制得的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗被认为是手术、放疗和化疗三大常规疗法后的第四大治疗方法。肿瘤的免疫治疗是激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。树突状细胞是由2011年诺贝尔生理学或医学奖获得者拉尔夫·斯坦曼在1973年所发现并命名的一种功能最强的抗原递呈细胞，能将肿瘤抗原的信息通过主要组织相容性复合物(MHC I和MHC II)限制性方式将多肽复合物作为抗原传递给CTL和Th1细胞，在诱导特异性抗肿瘤细胞免疫中起着关键作用。

自从1996年美国斯坦福大学医学中心Hsu等在Nature Medicine上报道全球首项肿瘤DC疫苗临床试验以来，截止到2011年7月16日，全球有关DC的临床试验共424项，其中274项为DC肿瘤疫苗临床试验，其中美国165项，占了半壁江山，中国6项(其中台湾3项)。

全球进行的肿瘤DC疫苗临床试验，大部分均采用自体外周血单个核细胞等分化为未成熟DC细胞后，利用各种类型的肿瘤抗原进行负载，再使用多种细胞因子促进DC细胞的成熟，最后将负载有肿瘤抗原信息的成熟DC细胞通过各种途径回输入人体。单个核细胞来源的DC细胞不能增殖，其数量取决于单个核细胞分化为未成熟DC的转化率。目前进行的临床试验，大部分采取的是贴壁法获得单个核细胞，这种方法所获得的贴壁细胞，除了单个核细胞外，还有大量的杂质细胞(如粒细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、Treg细胞等)，这些杂质细胞，会限制未成熟DC细胞的生产率。若是采用充分冲洗培养皿壁的方法来去除，又会不可避免的造成半贴壁状态的单个核细胞的大量丢失，这一方法只能获得单个核细胞1％～5％的产量，且病人个体之间、实验室之间、不同操作人员之间产率差别较大。少部分临床试验采用CD14单抗磁珠分选方法，但该法操作步骤复杂，操作时间长，而且其高昂的费用必然会限制临床应用。有文献表明，利用CD14单抗磁珠分选方法，虽然可以避免杂质细胞对单个核细胞转化为未成熟DC细胞的影响，但与贴壁法生成的DC细胞相比，其吞噬能力减弱。因此，CD14⁺单个核细胞的提取方法，仍需进一步改善。

临床研究中的DC细胞来源，主要来自于外周血的单个核细胞，其培养方法多种多样，比如经典的GM-CSF+IL-4刺激法；GM-CSF可以促进单个核细胞等向DC细胞转化，IL-4则起到抑制粒细胞和巨噬细胞产生的作用；但是该方法获得的未成熟DC细胞的数量和纯度较低。

DC细胞的成熟状态是决定DC疫苗有效性的一个关键因素。因为未成熟的DC致敏T细胞的能力有限，还可能诱导T细胞耐受。另外，与粘附性较强的未成熟DC相比，成熟DC的迁移能力更强，能更加有效地迁移至淋巴结的T细胞区，进而有效诱导免疫反应。经典的促进DC细胞成熟的方法是利用TNF-α或者利用COOKTAIL(TNF-α、IL-6、IL-1β、PEG2)刺激未成熟的DC细胞。然而，在一项III期的黑色素瘤的DC疫苗临床试验中，尽管使用了所谓“金标准”的COCKTAIL刺激DC细胞成熟，仍然未取得明显的临床疗效。研究者认为一个可能的原因是使用了PEG2，虽然可以提高DC细胞CCR7的表达并增强其向二级淋巴结转移的能力，但却会显著抑制DC细胞分泌IL-12的能力。为了提高DC细胞将抗原信息递呈给CTL和Th1并诱导特异性杀伤免疫反应，发展新型的刺激DC细胞成熟的方法势在必行。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出了一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，贴壁单个核细胞的制备方法，用于将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的试剂盒，利用贴壁单个核细胞制备未成熟DC细胞的方法，用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的试剂盒，利用未成熟DC细胞制备成熟DC细胞的方法，以及利用上述方法制得的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。

本发明涉及一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，所述的试剂盒含有如下成分：

CD14单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿。

其中，

所述的CD14单克隆抗体为含CD14单克隆抗体1-10μg／mL的包被液；

所述的CD14单克隆抗体选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。

本发明还涉及一种贴壁单个核细胞的制备方法，所述的方法包括如下步骤：