[发明专利]DC细胞的制备方法及其在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用

权利要求书

1.一种用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分：CD14单克隆抗体和由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成的培养瓶皿。

2.根据权利要求1所述的用于制备贴壁单个核细胞的试剂盒，其特征在于，所述的CD14单克隆抗体为含CD14单克隆抗体1-10μg／mL的包被液；所述的CD14单克隆抗体选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA中的任意一种类型。

3.一种贴壁单个核细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)用CD14单克隆抗体包被培养瓶皿；所述的培养瓶皿由聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯材料制成；

(2)从外周血、脐带血或骨髓中获取单个核细胞；

(3)用培养基将步骤(2)获得的单个核细胞吹打混匀，按2～5×10⁶／mL的浓度种植于步骤(1)用CD14单克隆抗体包被好的培养瓶皿中，5％CO₂、37℃条件下孵育2-6个小时；然后吸弃上清，轻柔洗涤后即获得贴壁单个核细胞。

4.根据权利要求3所述的贴壁单个核细胞的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的用CD14单克隆抗体包被培养瓶皿的方法为：将含1-10μg／mL的CD14单克隆抗体的包被液，加入至聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚乙烯制成的培养瓶皿中，将培养瓶皿用锡箔纸包住以避光，平放，4℃孵育过夜；步骤(2)中，所述的外周血为采自正常人或肿瘤患者的外周血；步骤(3)中，所述的培养基为GT-T551／AIM V／X-VIVO。

5.一种用于将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有如下成分：

500～1000U／mL GM-CSF、500～1000U／mL IL-4和500～1000U／mL IFN-α。

6.一种将贴壁单个核细胞制备成未成熟DC细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将单个核细胞贴壁2～4小时后，吸弃上清，用生理盐水、D-Hanks液或PBS轻轻冲洗培养瓶皿壁，吸弃上清，加入原体积的培养基、500～1000U／mL GM-CSF、500～1000U／mLIL-4、500～1000U／mL IFN-α和1～5％自体血浆或AB血浆，在5％CO₂、37℃条件下孵育培养；

(2)第2～4天，补加一倍体积的培养基、500～1000U／mL GM-CSF、500～1000U／mL IL-4、500～1000U／mL IFN-α和1～5％自体血浆或AB血浆，在5％CO₂、37℃条件下孵育培养；

(3)第4～6天，贴壁细胞分化为未成熟的DC细胞；收集悬浮生长的未成熟DC细胞。

7.一种用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的试剂盒，其特征在于，含有如下成分：

500～1000U／mLTNF-α和0.1～5KE／mL OK-432。

8.一种将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)第1天，将未成熟DC细胞按1～2×10⁶／mL的浓度种植于培养基中，加入肿瘤细胞裂解蛋白；放至5％CO₂、37℃条件下孵育培养；

(2)第2～3天，往步骤(1)中的DC细胞培养基中加入500～1000U／mL TNF-α、0.1～5KE／mL OK-432和1％～5％自体血浆或AB血浆，吹打混匀，放至5％CO₂、37℃条件下孵育培养24～48小时；

(3)收集刺激成熟的DC细胞。

9.根据权利要求8所述的用于将未成熟DC细胞制备成成熟DC细胞的方法，其特征在于，所述的肿瘤细胞裂解蛋白的终浓度为50～100μg／mL。

10.利用权利要求8或9所述的方法制备得到的成熟DC细胞在制备抗肿瘤细胞制剂中的应用。