[发明专利]一种改进的冰冻切片方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及组织样本制备及病理研究领域，具体涉及一种制备组织样品的改进的冰冻切片方法及其应用。 

背景技术

随着人类以及其它物种基因组测序的逐步完成，现代生物学的研究已经进入了后基因组时代—功能基因组时代。随着功能基因组发展的需要，针对不同生物大分子研究的高通量技术陆续发展，包括基因组技术，转录组技术，蛋白质组技术等。近年来，针对少量甚至单细胞样品的各种组学方法也开始发展并得到应用。随着海量数据处理和分析的需要，生物信息学也发展迅速。同时，在组织样品的分选方面，随着激光显微切割技术的应用，使得对于特定的组织类型和细胞类型的分选成为可能。这两方面技术发展的结合，使得在组织层面上进行系统生物学研究成为可能，对于现代分子病理学而言，也是一场革命性的变化。研究者将有可能根据研究的需要，分选出特定的组织结构或者细胞类型，进行全基因组尺度的定量测量和分析，从而对机体的正常发育和异常病变的分子机制有全面的深入理解，对疾病的预防和治疗提供重要的理论基础。 

基于组织形貌或者细胞类型的组学研究，主要的流程是：对要研究的临床组织样品或者模式动物组织样品进行切片和染色，找到目标组织结构或者细胞类型，利用激光分选技术分选出目标组织或者细胞类型，根据研究目的提取DNA、RNA或者蛋白，对少量样品放大之后，利用高通量技术（例如基因芯片、二代测序技术或者蛋白质组学等方法）对样品内的生物分子进行全基因组尺度的定量分析。在样品的制备方面，进行这类研究的必要条件是在找到特定组织或者细胞结构的同时，保持高质量的生物分子结构。 

目前组织样品的制样方法主要有三类，一类是石蜡切片，一类是冰冻切片，一类是固定冰冻切片。这三种方法各有优缺点。石蜡切片的基本流程是新鲜样品固定，脱水，树脂渗透和聚合，然后进行切片。切片好之后进行脱蜡，染色，进行下游的分子生物学操作。石蜡切片的优点是切片比较薄，固定之后的样品能保持比较好的组织学形貌。缺点是生物大 分子的质量，特别是RNA和蛋白的质量和抽提效率比较差，一般难以进行全基因组的分析。冰冻切片样品的基本流程是将新鲜样品直接用液氮速冻，进行冰冻切片，染色，然后进行下游的分子生物学研究。该方法的优点是能保持好的RNA质量，缺点是组织结构的形貌保持较差，形态辨认困难。固定冰冻切片的基本流程是将新鲜样品固定，直接进行冰冻切片，染色，然后进行下游的分子生物学研究。该方法的优点是能保持较好的形貌，抗原的空间结构保持较好，缺点是，虽然生物大分子的质量较石蜡切片有所改善，但是还是不足以满足大规模分析的样品质量要求。这两类冰冻切片方法对于含水量大，体积也较大的组织，由于细胞内容易形成冰晶的问题，样品结构保持非常差，不能满足结构或者细胞形态分辨的要求。 

因此，目前系统生物学和分子病理学发展需要，急需一种既能完整保持组织结构，又能保持高质量的生物大分子的组织样品制备方法。 

在优化组织样品制备方法上，研究人员对于样品的固定剂选择和样品的包埋方式等做了一系列的尝试。在组织样品的制备中，固定剂的选择和使用对后期样品形貌和生物大分子质量影响最大。研究人员尝试了不同固定剂的使用，例如Melissa L.Cox等人考察了不同的固定剂70%neutral-buffered formalin，modified Davidson’s II，70%ethanol，UMFIX，modified Carnoy’s，modified methacarn，Bouin’s，phosphate-buffered saline和30%sucrose对于组织样品形貌和RNA质量的影响。在这些固定剂中，虽然modified methacarn能一定程度提高RNA的质量。Mark A.Perlmutter，John W.Gillespie等人用70%的乙醇温和固定组织样品，然后进行石蜡包埋，这种方法能保持组织的精细结构，并适当提高RNA的质量。VaskerBhattacherjee等人利用预冷的4%多聚甲醛（paraformaldehyde）对组织进行短时间固定，然后进行冰冻切片。经过这些尝试，虽然样品一定程度地提到了RNA的质量，但是总体上来说，RNA的质量还是不能满足对于高通量测序的要求。另外，用液氮预冷的异戊烷也被用于组织样品的直接速冻，但是对于含水量大的大样品，该方法还是不能保持精细的组织结构。