[发明专利]AFP和GM-CSF双基因共表达重组载体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组载体及其制备方法和应用，特别是涉及一种双基因共表达重组载体及其制备方法和应用。

背景技术

原发性肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是最常见的恶性肿瘤之一，我国是肝癌的高发区，每年发生的肝癌占全世界的50％以上，肝癌死亡率己占全国肿瘤死亡率的第二位，是一种严重威胁人们生命健康的疾病。手术切除是目前疗效最好的肝癌治疗手段，目前肝移植技术亦相当成熟，但由于费用高、供体来源困难，术后使用抗排斥药物会因免疫抑制而使残癌生长更快和出现转移等问题，对中晚期肝癌的疗效欠佳。

近年来，随着分子生物学和肿瘤免疫学等学科的飞速发展，肿瘤免疫治疗已成为肿瘤治疗研究的热点，多种免疫治疗方法已用于肝癌的临床研究，比如细胞因子治疗、自体完整的肿瘤细胞疫苗、效应细胞回输治疗、以树突状细胞为基础的肝癌疫苗等。研究学者认为，肝癌特别适宜于免疫治疗，原因如下：（1）肝癌化疗效果不明显，常规不应进行化疗，因而免疫系统不会因为化疗而受损；（2）肝癌肿瘤生长相对较慢，有足够时间用以开展和加强有效的抗肿瘤免疫效应；（3）肝脏足多血供器官，免疫效应细胞容易浸润并增殖；（4）肝癌病灶多局限于肝内，临床随访时采用标准的影像学技术比较容易对肿瘤负荷进行定量评估，有利于治疗效果的判断。其中，细胞因子基因免疫治疗是肿瘤免疫治疗与基因治疗的结合，其通过将具有抗肿瘤作用的细胞因子基因导入宿主体内，并使之稳定有效地表达，使体内持续存在一定水平的内源性细胞因子，以发挥抗肿瘤的作用。然而，目前的细胞因子基因免疫治疗方法缺乏肿瘤靶向性，其抗肿瘤效果有待提高。

粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）是一种重要的免疫调节分子，它不仅可诱导在T细胞免疫反应中起关键作用的DC细胞成熟、分化，而且在免疫治疗过程中可增强主要和次要的抗体反应，以促进DC等APC分化、成熟和活化以及上调协同刺激分子（如CD86）的表达水平，增强中性粒细胞、单核巨噬细胞、嗜酸性粒细胞对肿瘤细胞的吞噬作用和ADCC效应等活性，促进Th、Tc、NK细胞在肿瘤部位浸润，抑制肿瘤细胞的生长。GM-CSF目前已被广泛应用于肿瘤的免疫治疗，GM-CSF以其显著的免疫调节作用和低毒性，成为肿瘤疫苗重要的免疫佐剂，转染GM-CSF基因的肿瘤疫苗在黑色素瘤、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等肿瘤的免疫治疗研究中均取得了显著效果。然而，目前的GM-CSF基因免疫治疗方法只是局部地提高机体的GM-CSF蛋白表达水平，其免疫调节作用、抗肿瘤能力较小，而且缺乏免疫治疗的靶向性。

甲胎蛋白（Alpha Fetoprotein，AFP）是一个胚胎特异性的α-球蛋白，是哺乳动物早期胚胎血清中的一个重要的组份。正常情况下，AFP是由胎儿的肝脏和卵黄囊产生的，胎儿出生后，血清中的AFP含量迅速下降，在正常的成人体内是检测不到或仅有极其微量的AFP。AFP是人类发现的第一个具有临床应用价值的肿瘤标志物，一直以来被认为是诊断原发性肝细胞癌的重要标志物。在成人中，约有80%的原发性肝细胞癌患者的血清中，都可以检测到AFP的表达，显示AFP筛查是发现早期肝癌的一种高效的手段。AFP可以作为肿瘤标志物，作为肿瘤免疫治疗的靶位，刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，肿瘤细胞可以在其表面表达并递呈AFP多肽与MHC复合物，进而刺激机体免疫系统，产生特异性杀伤性T细胞，杀伤肿瘤细胞。研究表明，AFP可以和多种抗癌药物结合，并通过受体介导的胞吞作用选择性地进入肿瘤细胞，从而靶向、高效地杀死肿瘤细胞。

发明内容

基于此，有必要针对现有技术存在的缺陷，提供一种AFP和GM-CSF双基因共表达重组载体，该重组载体可用于肝癌的基因免疫治疗，既能发挥细胞因子的的免疫调节作用，又能靶向性地针对肝癌产生特异性抗肿瘤效应。

本发明的另一个目的是，提供所述AFP和GM-CSF双基因共表达重组载体的制备方法。

本发明的再一个目的是，提供所述AFP和GM-CSF双基因共表达重组载体在肝癌的基因免疫治疗中的应用。