[发明专利]一种植酸酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于功能基因筛选技术领域，具体涉及一种植酸酶及其应用。 

背景技术

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（EC3.1.3.8），是催化植酸以及植酸盐水解成肌醇与磷酸（或磷酸盐）的一类酶的总称。 

植酸酶作为一种优良的饲料添加剂目前被广泛地应用于畜牧业生产中，它能够提高动物对磷元素的利用率，以及蛋白质、氨基酸、各种矿物元素的利用率，解除动物植物性饲料中植酸的抗营养作用，提高植物性饲料的营养价值，同时降低动物排泄物对环境的污染，在动物生产以及在环境保护中，是极为有效的一种添加剂，具有重要的应用价值。另外，农业部、环保部联合印发的《全国畜禽养殖污染防治“十二五”规划》中指出，将重点治理畜禽养殖污染，这也给植酸酶应用提供了更有利的机遇。 

目前研究的植酸酶主要来源于Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.,1984;Meyhack et al.,1982)、Aspergillus niger(MacRae,1998)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(Van Loon,1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.,1993;Ehlich et al.,1993;Bin Y et al.,1998)等。不同来源的植酸酶具有不同的酶学性质，但目前的植酸酶普遍存在耐热性不高，表达量低的问题，制约了植酸酶在饲料领域更为广泛的应用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种新型植酸酶及其应用，本发明从黑葡萄穗霉（Stachybotrys chartarum）中得到一个编码植酸酶的基因，并将该基因进行克隆，在黑曲霉（Aspergillus niger）中表达，筛选得到高效表达植酸酶的基因工程菌株，从而为高密度发酵和工业化生产奠定基础。 

本发明一方面提供了一种来源于黑葡萄穗霉的植酸酶，其特征在于： 

1）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的植酸酶； 

2）在1）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有1）中植酸酶活性的酶。 

本发明另一方面提供了编码上述植酸酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。 

本发明还提供了一种表达载体，其包含上述编码植酸酶基因的核苷酸序列。 

本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述植酸酶基因 的表达载体。 

上述表达宿主细胞为黑曲霉（Aspergillus niger）。 

本发明的植酸酶用于制备饲料添加剂。 

本发明构建的黑曲霉工程菌能高效表达植酸酶，摇瓶发酵结果显示其酶活为434U/mL。本发明的植酸酶作为饲料添加剂，能显著提高肉鸡的日采食、日增重，降低料肉比，增加养殖户的经济效益。此外，在日粮中添加本发明的重组植酸酶可使肉鸡的磷排泄量比对照组降低13.8%，说明本发明的植酸酶能有效提高肉鸡对饲料中磷的吸收率，减少含磷废物的排泄，有利于保护生态环境。 

附图说明

图1：本发明构建的pGm-Scphy重组表达载体质粒图谱。 

图2：黑曲霉WLScphy发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，其中箭头所指59kD处为重组表达的植酸酶。 

图3：重组表达的植酸酶相对酶活-温度曲线图。 

图4：重组表达的植酸酶相对酶活-pH曲线图。 

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范围。 

实施例1：植酸酶基因的克隆 

使用真菌基因组DNA提取试剂盒(Omega)从黑葡萄穗霉过夜培养物中提取基因组DNA。 

以黑葡萄穗霉基因组DNA为扩增模板扩增黑葡萄穗霉中的植酸酶基因，其中所用到的正向引物P-F序列为(下划线所示序列为AflII酶切位点)；