[发明专利]抗冠状病毒药物高通量筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、病毒学、生物化学和生物医药技术研究领域。特别是涉及以冠状病毒N7甲基转移酶能互补酵母遗传系统细胞生长为基础，而建立的一种抗冠状病毒药物高通量筛选平台。

背景技术

冠状病毒感染可以造成包括人在内的多种动物的致病，造成急性和慢性呼吸道、肠道及中枢神经系统疾病。引起的人类疾病主要是以发热、干咳、胸闷为主要症状的呼吸系统感染（包括严重急性呼吸综合征，Severe Acute Respiratory Syndromes，简称SARS）(Rota et al.,2003)；还可引起婴儿和新生儿急性肠胃炎；另外，冠状病毒也是成人普通感冒的主要病原之一。目前，中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus(MERS-CoV)）于2012年夏天爆发，截至2013年5月14日，被新型冠状病毒感染的患者中有53%已经死亡，高致死率造成了严重的社会恐慌和经济损失(Cauchemez et al.,2013;de Groot et al.,2013;de Wilde et al.,2013)。截止目前，针对冠状病毒仍无有效的疫苗或者特异性治疗方法，且冠状病毒的广泛存在和高重组率易发生新发野生型病毒，因而是全世界面临的主要健康威胁之一，使得人们不得不通过各种病毒抑制剂筛选方法找寻适当的药物分子(Stockman et al.,2006)。

控制SARS冠状病毒及新发冠状病毒爆发以及传播的最有力手段，就是开发一种有效的抗病毒方法。目前主要的手段包括：开发失活的SARS冠状病毒疫苗、重组亚单位疫苗、以DNA为基础的重组疫苗和以病毒为载体的重组疫苗(Roberts et al.,2008)；开发抑制SARS-CoV与宿主受体结合(Sainz et al.,2006)、进而抑制SARS-CoV进入宿主细胞(Lang et al.,2011)的药物；开发抑制SARS-CoV的复制及转录的药物（如靶向病毒蛋白酶或其他复制转录酶的药物）(Ghosh et al.,2009)和抑制SARS-CoV的组装、出芽及释放的药物。但目前均未有进入临床应用的成果。

高等真核生物细胞信使RNA（mRNA）(Shatkin,1976;Shimotohno et al.,1977;Shuman,2001)及大部分病毒RNA的5’-端均具有N7甲基化修饰的帽子结构。同时，5’端的帽子修饰具有很多重要的生物学功能：保护信使RNA避免被5’外切酶降解(Schwer et al.,1998)；指导前体信使RNA的剪切及核输出(Lewis and Izaurralde,1997)；保证信使RNA的稳定性及有效的翻译(Banerjee,1980;Furuichi and Shatkin,2000;Muthukrishnan et al.,1975)。除此以外，病毒RNA的帽子结构已被证明可以帮助冠状病毒逃避宿主细胞内免疫因子MDA5（melanoma differentiation-associated gene5）的识别(Zust et al.,2011)及干扰素诱导蛋白IFIT（IFN-induced proteins with tetratricopeptide repeats）介导的免疫抑制(Daffis et al.,2010)。由于病毒本身的加帽机制与宿主细胞内信使RNA的加帽存在差别，使病毒加帽酶作为抗病毒药物靶标成为可能(Bouvet et al.,2010;Dong et al.,2008;Ke et al.,2012)。目前一些抑制病毒加帽系统的广谱药物，如AdoHcy、Sinfungin、ATA等可以抑制冠状病毒的甲基转移酶的活性(Bouvet et al.,2010)。但是这些非特异性的抑制冠状病毒甲基转移酶的药物对宿主本身造成较大的副作用。因此，开发一种能够快速、有效，且在筛选过程中能准确评估药物对宿主本身加帽系统影响的冠状病毒药物抑制筛选平台极为重要。具有较大的应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于酵母遗传系统的抗冠状病毒药物高通量筛选方法。

为实现上述目的，本发明首先提供一种用于抗冠状病毒药物高通量筛选的细胞株，其包括表达人N7甲基转移酶但自身N7甲基转移酶缺失的酵母，以及表达冠状病毒的非结构蛋白14但自身N7甲基转移酶缺失的酵母。