[发明专利]结直肠癌微卫星不稳定性扩增体系及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR扩增体系，以及使用该扩增体系的检测产品，属于生物技术领域。

背景技术

结直肠癌在国内外发病率均逐渐升高，是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一，研究发现基因组的不稳定性在结直肠癌的发病机制中占重要的地位。基因组的不稳定性包括染色体不稳定性(chromosomal instability，CI)和微卫星不稳定性(microsatellite instability，MSI)。以往对于结直肠癌的发病研究表明，染色体不稳定（chromo?some instability）为结直肠癌发病的主要原因，染色体不稳定性指全部染色体数量的增加或减少速度加快。而近年的研究发现微卫星不稳定性为结直肠癌发病的另一重要机制。

微卫星又称短串联重复序列(Short tandem repeats,STRs)、简单重复顺序(Simple sequences repeats,SSRs)，由1～6个核苷酸组成，具有高度多态性，广泛存在于原核及真核生物基因组中，特别是以二核苷酸重复序列即(CA/GT)n最为常见，n为重复次数，通常为15～60次。微卫星从基因的结构分析，重复序列位于启动子、基因编码区、内含子区域或内含子与外显子的交界区。微卫星能自身特异性的结合蛋白质或直接编码蛋白质，有的则可能参与染色单体的折叠及端粒的形成等。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥基因调控作用，是一类新的、多态信息容量高的分子标记。

微卫星不稳定性是指由于复制错误(replication error, RER)引起的简单重复序列的增加或丢失。其发生主要是参与配对错误修复的基因功能缺陷而产生一种缺陷蛋白质，因而不能正常的校正复制错误，从而引起微卫星DNA的改变，使其不能正常地发挥调控作用，导致细胞增殖及分化异常，促发恶性肿瘤形成。据文献报道，MSI与结直肠癌、胃癌、子宫内膜癌等肿瘤发生密切相关。大约15%的结直肠癌中存在MSI现象，其中典型的遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynon-polyposis colorectal cancer，HNPCC）患者90%以上为MSI瘤。  MSI检测对结直肠癌患者其意义重大。与无MSI的结直肠癌相比，携带有MSI的结直肠癌其预后较好，并且二者药物反应也不一样。1997年Bethesda指导纲要推荐应用5个微卫星位点来进行结直肠癌的检测,即单碱基重复序列BAT-25和BAT-26、双碱基重复序列D2S123、D5S346和D17S250,并对MSI作出了定义。比较肿瘤和匹配的正常DNA,5个位点中有2个或2个以上位点有重复序列长度变化者为高度MSI(highfrequency MSI,MSI-H),若只有1个位点有长度变化者为低度MSI(lowfrequency MSI,MSI-L),无任何位点的变化称为微卫星稳定(microsatellite stable,MSS)。

在2011年关于结直肠癌筛查的NCCN Guidelines中，MSI已成为首要检测项目。①MSI检测可用于HNPCC的筛查。超过90%的HNPCC患者肿瘤组织表现MSI，MSI在HNPCC中已经成为的重要标志物；当高度怀疑HNPCC时，需检测MSI。②MSI-H的结直肠癌患者预后良好的标志物。MSI-H结肠癌患者生存期更长，较少复发，被认为是预后好的标志之一。③MSI检测可用于氟尿嘧啶类药物的辅助疗效预测。2009年ASCO会议报道，在接受5-FU辅助化疗的II期和III期结肠癌患者中，MSI是独立的预后因素。现有技术的微卫星不稳定性一般可通过如下2种方法检测：

1）PCR法：选定特异的引物，以自身正常组织作对照，在体外对微卫星位点进行PCR扩增，扩增后的产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳，经各种显示系统（放射自显影、银染等）分析有无迁移率的改变。

2）基因检测，即对相关的DNA直接进行测序。但因进行基因检测价格昂贵，所需试验条件较高，在临床应用尚未普及。

PCR法已成为目前常用检测方法并已被证明是最有效的初筛手段。但普通PCR分管检测五个微卫星基因，产物做凝胶电泳的方法，存在操作繁琐、成本高等诸多缺陷。