[发明专利]棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，属于生物技术领域。

背景技术

新疆多浪羊产于喀什地区麦盖提县，该羊具有体格大、生长发育快、产肉率高、繁殖率高、遗传性稳定等特点，被广泛养殖于喀什和阿克苏各县市，是南疆畜牧业发展的主要养殖家畜之一。

棉酚(gossypol)是通过棉花中倍半萜(十五碳)的法尼基焦磷酸环化后合成的次生代谢产物，存在于锦葵科某些植物的根、茎、种子中，曾作为男性节育药为人们所熟知，具有明显的诱导肿瘤细胞凋亡的能力，并能抑制细胞能量代谢导致细胞死亡。新疆是我国主要棉产区，而南疆的广大牧民主要以棉副产品作为主要的饲料来源养殖绵羊，棉副产品中含有的棉酚会对绵羊的健康产生一定程度的影响，当超过一定量会使绵羊中毒甚至死亡，因而绵羊的棉酚中毒是亟待解决的问题。目前，解决绵羊棉酚中毒的问题大多是从饲养的角度入手，减少绵羊对棉副产品中棉酚的摄入量来解决棉酚中毒问题。绵羊对棉酚有一定的耐受现象，中毒后一段时间不摄入棉酚，绵羊的中毒症状会逐渐消失。为何会出现此现象，未见有相关研究来揭示其机理。因而，该研究试图从免疫分子角度来揭示绵羊棉酚中毒后逐渐康复的机理，试图从免疫学角度来解决绵羊棉酚中毒的问题。

IL-18是通过NK细胞的活性发挥抗肿瘤作用，对细胞的损伤具有修复作用，能显著刺激TH₁细胞产生干扰素，同时具有很强免疫调节作用。应用荧光定量PCR技术探讨IL-18基因的mRNA表达量的变化，确定棉酚作用的最佳浓度和最佳作用时间，探讨IL-18在绵羊棉酚损伤细胞中的变化规律，试图寻找免疫分子在解除多浪羊棉酚中毒方面的作用。

发明内容

本发明通过对不同浓度的棉酚作用于新疆多浪羊淋巴细胞不同时间，应用荧光定PCR技术，分析棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达的影响，确定棉酚作用的最佳浓度和最佳作用时间，探讨IL-18在绵羊棉酚损伤细胞中的变化规律，试图寻找免疫分子在解除多浪羊棉酚中毒方面的作用，并以此作为解除棉酚对新疆多浪羊危害方面研究的重要依据。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，具体方法和步骤如下：

(1)分离和培养淋巴细胞：采集健康成年多浪羊新鲜抗凝血与Hank′s液等比例混匀，然后加一定体积的人淋巴细胞分离液，以2000g／min的离心速度离心20min后，得到淋巴细胞，然后将淋巴细胞悬浮于RPMI1640中混匀，分别于细胞培养瓶中加入棉酚，使终浓度为(5μmol／L、10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L、25μmol／L、30μmol／L、35μmol／L)于37℃、CO₂培养箱(5％CO₂)中培养；

(2)提取总RNA：采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴细胞的总RNA。不同浓度、不同时间棉酚作用的淋巴细胞培养液1mL／管分装，以2000g／min，离心15min中后弃上清，加入1mLTrizol后充分混匀，室温静置5-10min裂解，然后加入200μL氯仿，涡旋15s，静置2min，再以12000g离心15min，加500μL异丙醇，放在15-30℃的环境中孵育10min后，12000g离心10min，弃去上清，加入1mL的75％乙醇，涡旋混匀，4℃，7500g离心5min，弃去上清液，室温或真空干燥5～10min，然后将RNA溶于20μL的DEPC水中，55～60℃水浴10min，于-70℃保存，通过琼脂糖凝胶电泳对所提取的总RNA进行检测，并用核酸测定仪测定其浓度和纯度；

(3)合成cDNA：将检测好的总RNA取出，放于冰盒中，去16μL总RNA为模板，加入dNTP2μL，Oligod(T)2μL，混合后于65℃温浴5min后，置冰上2min，瞬时离心10s，然后再依次加入5×Primerscript buffer8μL，RNAse Inhibitor1μL，Primerscript RTrase2μL，RNAsefree H₂O9μL，总计40μL的反应体系，放入42℃水浴锅孵育45min，再放入70℃水浴锅，15min，保存于-20℃冰箱备用；

(4)cDNA的纯化：采用QIAquick PCR Purification Kit进行cDNA的纯化；