[发明专利]55型腺病毒的特异性检测用引物探针组合和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用荧光PCR技术，特异性检测样品中55型腺病毒核酸存在的寡核苷酸序列组合，以及包括该组合的试剂盒。

背景技术

腺病毒是一种无包膜、线状的双链DNA病毒，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染。

腺病毒引起的呼吸道感染暴发疫情在国内外时有报道，主要发生于封闭环境内的人群，如寄宿制学校，托幼机构。临床症状除发热、寒战、头痛、咳嗽外，常有明显的咽痛及咽喉部溃疡；在临床上，腺病毒呼吸道感染分为以下几种类型：急性发热性咽喉炎、咽结膜炎、急性支气管炎和肺炎4中临床类型。

目前，腺病毒共有55型，腺病毒4、7和21型是部队入伍新兵及其他在封闭环境内的人群，如寄宿制学校、托幼机构急性呼吸道疾病暴发的常见病原体，55型腺病毒在我国发现，是腺病毒11型与15型基因重组而成的新型病毒，曾于2006年在我国北方学校学生群体中引起呼吸道暴发疫情，以轻型病例为主。

在实验室检测中，PCR法由于其快速简便的特点逐渐呈现出要替代以细菌培养和血清学检测为主的传统检测方法的趋势。而对于PCR方法来说，引物的特异性是其检测的特异性和敏感性的基础。本发明针对55型腺病毒特异的靶序列设计引物和Taqman探针，利用real-time PCR的方法，用来鉴别检测样品中55型腺病毒核酸，可以快速获得特异性检测结果。

发明内容

为了更加准确地检测样品 55型腺病毒核酸存在，本发明提供一种特异性检测样品中55型腺病毒的寡核苷酸序列组合和包含该组合的试剂盒，其特征在于序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于核酸扩增的引物为：

P1：5`-CAGGATGCTTCGGAGTACCT-3`, 

P2：5`-CTTATTTCCCAGATTGAAGTAGGT-3`。

P1和P2为针对55型腺病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性引物。

本发明的特征还在于，序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针为：

Probe1：5`-X<sub>1</sub>-CCGGGTCTGGTGCAGTTTGCC-Y<sub>1</sub>-3`。

X₁为荧光报告基团，Y₁为荧光淬灭基团。Probe1为针对55型腺病毒基因组特异性序列设计并经预实验筛选出的特异性探针。

本发明的特征还在于，试剂盒包括PCR反应液、酶混合液、阴性质控品和阳性质控品。其中PCR反应液主要含有上述的引物和探针、反应缓冲液、Mg²⁺和dNTP等，酶混合液主要含有热启动Taq酶，阴性质控品为去离子水，阳性质控品为含有检测靶序列的核酸。

本发明的一优选实施方案为： 序列组合或试剂盒的PCR反应液中用于荧光信号监测的寡核苷酸探针的荧光基团分，其中Probe1荧光报告基团X₁为Fam，荧光淬灭基团Y₁为Eclipse。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应液包含上述特异性引物和特异性探针，属于实时荧光单重PCR检测，可在同一个反应体系中对百55型腺病毒核酸进行检测。

本发明的另一优选实施方案为：试剂盒的PCR反应循环参数为94℃，2min; 进入循环阶段：94℃变性10s，56℃退火50s，72℃延伸15s，共反应40个循环。

本发明的另一优选实施方案，试剂盒选用的PCR反应体系为20μl，包括2×PCR缓冲液10 μl、10mmol/L dNTP 1.0μl、25μmol/L引物各0.5 μl、10μmol/L 探针0.2 μl、热启动Taq酶混合液0.4μl、样品DNA 2μl，加灭菌水至终体系20 μl。

本发明提供的试剂盒对55型腺病毒核酸的检测下限为20个拷贝每反应体系。

本发明分别根据55型腺病毒基因组保守区分别设计特异性引物和探针，提供的试剂盒可以检出55型腺病毒的核酸，但不能检出非55型腺病毒病原体的核酸，说明试剂盒具有很好的特异性。

本发明提供的试剂盒2小时内即可完成检测，可为55型腺病毒的疾病监测和临床诊断提供实验依据。

附图说明