[发明专利]基于核酸适配体荧光各向异性检测赭曲霉素A的方法

说明书

技术领域

本发明涉及真菌毒素检测技术，具体属于一种基于核酸适配体检测赭曲霉素A的荧光检测技术。

背景技术

赭曲霉素A，英文名称为Ochratoxin A，是一种影响广泛的真菌毒素，曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生的二级代谢产物，产毒菌包括赭曲霉、疣孢青霉和碳黑曲霉等。赭曲霉素A可以直接污染谷类、饲料、水果、干果等农作物和多种食品，人和动物通过摄入污染的植物性食物而吸收进入体内，同时也可因赭曲霉素A在动物体内的蓄积作用而通过摄入动物性食物进入人体内。赭曲霉素A具有很强的肾脏毒性、免疫抑制毒性、神经毒性、致癌性、致畸性。高灵敏、高特异检测赭曲霉素在食品安全和环境健康方面具有重要的意义。检测方法目前主要包括薄层色谱、高效液相色谱、酶联免疫分析、液质联用等方法。这些方法往往需要昂贵的仪器和复杂的操作步骤。采用免疫抗体的分析方法需要利用特异性识别赭曲霉素A的抗体，抗体的制备往往成本高，制备重现性差，稳定性好，抗体保存和运输的条件要求高。

核酸适配体(Aptamer)是通过SELEX技术筛选出的一类能与目标分子特异性结合的寡聚核苷酸片段，对目标分子具有高度亲和力和专一性的识别能力(Ellington,A.D.and Szostak,J.W.Nature1990,346,818–822.Tuerk,C.and Gold,L.Science1990,249,505–510.)。核酸适配体作为亲和配体，与免疫抗体相比，具有显著的优点：具有高的亲和力和高特异性；筛选制备方便；稳定性高；易于化学修饰。因此核酸适配体在分析检测和传感领域中显示出很多优点，可以克服常用的免疫抗体的在稳定性和制备等的一些局限，显示出应用前景(Liu,J.;Cao,Z.;Lu,Y.Chem.Rev.2009,109,1948–1998;Cho,E.J.;Lee,J.-W.;Ellington,A.D.Annu.Rev.Anal.Chem.2009,2,241–264.)。已报道的利用核酸适配体检测赭曲霉素A的方法往往比较复杂，需要采用合理的设计和分离等，如电化学传感、亲和色谱等（Yang,X.H.;Kong,W.J.;Yang,M.H.;Zhao,M.;Ouyang,Z.Chin.J.Anal.Chem.2013,41,297?306；Hayat,A.;Paniel,N.;Rhouati,A.;Marty,J.-L.;Barthelmebs,L.Food Control2012,26,401–415；Chapuis-Hugon,F.;du Boisbaudry,A.;Madru,B.;Pichon,V.Anal.Bioanal.Chem.2011,400,1199–1207.）。

本发明采用荧光染料四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，简称TMR）标记的核酸适配体建立了一种简单方便的荧光各向异性（荧光偏振）法检测赭曲霉素A的检测技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于核酸适配体荧光各向异性检测赭曲霉素A的方法和相应的试剂，该方法具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高的优点。

本发明是利用赭曲霉素A与四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，简称TMR）修饰的核酸适配体的选择性结合，引起TMR修饰的核酸适配体的荧光各向异性（荧光偏振）改变，通过测定荧光各向异性（荧光偏振）的变化，实现对赭曲霉素A的定量检测。（见图1）。

本发明提供的一种荧光染料四甲基罗丹明（tetramethylrhodamine，简称TMR）标记的核酸适配体，其核酸适配体的核苷酸序列为SEQ ID NO：1（5’-GAT CGG GTG TGG GTG GCGTAA AGG GAG CAT CGG ACA-3’）；TMR标记到核苷酸序列SEQ ID NO：1的5’端开始的第10个T碱基上，或第8个T碱基上，或第19个T碱基上。

本发明提供的一种基于核酸适配体荧光各向异性检测赭曲霉素A的方法，步骤包括：将TMR标记的核酸适配体，在结合缓冲溶液中与赭曲霉素A混合，温育，测定TMR标记的核酸适配体的荧光各向异性，激发波长为560纳米，发射波长为578纳米，依据核酸适配体的荧光各向异性的变化，即可求得被测样品中赭曲霉素A的浓度。

所述的结合缓冲溶液为：10mM Tris-HCl,120mM NaCl,20mM CaCl₂,0.1%Tween20，pH8.5。

与现有技术相比本发明具有如下的优点和效果：