[发明专利]具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列

说明书

技术领域

本发明涉及一种海蚯蚓蛋白酶，具体地说是一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列，属于医药生物工程领域。

背景技术

 蚯蚓，又名地龙，作为中国传统药物已应用2000多年。蚯蚓具有活血化瘀、清热解毒、提高机体免疫功能的作用，长期以来可用于细菌、病毒感染性疾病、免疫性疾病的治疗。近年来蚯蚓提取物的抑制血小板凝聚、溶解血栓的作用使其用于心血管疾病的临床治疗。另外，从蚯蚓中还提取到抗肿瘤活性的物质，多为蛋白酶组分，它能抑制肿瘤细胞生长，并且作为生物反应调节剂，具有辐射增效和化学增效作用。实验及临床研究证明蚯蚓提取物可以从多个方面抑制肿瘤的发生发展，有望成为新型抗肿瘤药物．

海洋生物海蚯蚓(Arenicola cristata)与蚯蚓同属于环节动物门，但纲目科不同。海蚯蚓为多毛纲小头虫目沙蠾科，形似蚯蚓，生活于潮间带多沙地带，营管居生活，故名海蚯蚓，主要分布于我国渤海、黄海沿岸。海蚯蚓始载于《中国药用动物志》，用于痈疮肿毒，有清热解毒之功效。目前对海蚯蚓的研究方向主要集中在其形态结构、生理代谢、营养成分分析等方面。根据蚯蚓目前的研究状况，我们推测在海蚯蚓体内也存在多种蛋白酶，充分研究这些蛋白酶具有广阔的应用前景。但除了我们实验室报道了一个基因序列（ZL201210236225.8）外，尚没有其他海蚯蚓蛋白酶新基因序列的报道。我们对已报道的环节动物门蚯蚓（Eisenia fetida DQ836917.1、Eisenia fetidaDQ418454.1、Lumbricus rubellus U25647.1）和单环刺螠（Urechis unicinctus HM623463.1）cDNA序列进行多重比对，采用同源序列克隆法，通过3′RACE、5′RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。

发明内容

本发明提供一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列及其氨基酸序列。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

以来自海蚯蚓消化道上皮细胞的mRNA为模板，采用同源序列克隆法，通过3′RACE、5′RACE技术，获得了一种编码具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的cDNA序列。将该序列表达活性肽的部分克隆到表达载体上，在原核表达系统大肠杆菌中生产具有抗肿瘤活性的重组海蚯蚓蛋白酶。重组海蚯蚓蛋白酶具有抑制肿瘤细胞增殖的活性，可作为新型的基因工程药物。

海蚯蚓蛋白酶cDNA序列的克隆：

（1）设计引物：根据环节动物门蚯蚓和单环刺螠的蛋白酶较保守序列设计引物。

（2）目的基因cDNA 3′端序列扩增及测序：由步骤（1）得到引物，和来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，通过3′RACE（cDNA3′末端快速扩增技术）扩增海蚯蚓蛋白酶的基因cDNA 3′端序列。 PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（3）目的基因cDNA 5′端序列扩增及测序：根据获得的目的基因cDNA 3′端序列设计两对特异性引物，以来自海蚯蚓消化道组织的总cDNA为模板，采用5′RACE（cDNA 5′末端快速扩增技术），进行套式PCR，扩增海蚯蚓蛋白酶基因cDNA 5′端序列。PCR产物胶回收后分别连TA克隆载体，转化细菌E.coli DH5α，测序。

（4）拼接：应用contigexpress软件对步骤（2）和（3）得到的目的基因cDNA 3′端和5′端序列进行拼接，获得本发明的海蚯蚓蛋白酶编码基因的DNA（mRNA）序列。

（5）根据上述步骤（4）得到的DNA（mRNA）序列，使用DNAMAN软件，获得该海蚯蚓蛋白酶cDNA编码的氨基酸序列。

一种具有抗肿瘤活性的海蚯蚓蛋白酶的编码基因序列，该序列如下：