[发明专利]一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的基因工程菌构建及其应用。

背景技术

核糖（Ribose，C₅H₁₀O₅）是一种典型的五碳糖，是各种核糖核酸(RNA)、核苷酸辅酶、以及ATP、NADP的组成成分，与生物遗传的关系密切，对生物体的生理活性具有重要的调控作用。自然界中的核糖主要以D-核糖形态存在，D-核糖以呋喃糖型广泛存在于植物和动物细胞中，D-核糖也是多种维生素、辅酶以及某些抗生素，如新霉素A、B和巴龙霉素的成分；L-核糖是与D-核糖相对的手性对映异构体，在自然界和生物体内并不存在，是极为昂贵的稀有糖类。纯净的L-核糖是白色晶体或白色晶体粉末，带有甜味；可溶于水、乙醇、甲醇、不溶于乙醚、苯和丙酮。L-核糖具有良好的抗肿瘤抗病毒能力且对正常细胞的毒副作用很小。L-核糖是重要的药物合成中间体，广泛用于合成具有抗病毒活性的核苷类化合物，在抗艾滋病、抗病毒中间体方面显示强大的潜能。L-核糖经还原脱氧水解等加工还可生产2-脱氧-L-核糖，该中间体与腺嘌呤等有机碱形成的核苷衍生物在癌症、乙肝、丙肝等疾病的治疗方面也具有很大的应用潜能。

随着L-核糖应用面的不断扩大，全球L-核糖的需求量逐年增加，人们对制备和开发适应工业化生产L-核糖方法的兴趣日益浓厚。随着L-核糖应用面的不断扩大，全球L-核糖的需求量逐年增加，人们对制备和开发适应工业化生产L-核糖方法的兴趣日益浓厚。

尽管目前采用化学法合成L-核糖，在合成步骤与收率等方面均有了较大的提高，但仍存在合成工艺路线复杂，反应步骤繁琐，试剂昂贵，总收率低，需使用大量有机溶剂和产生有害的副产物等问题，难以适应工业化生产的要求。通过微生物或酶进行生物转化生产L-核糖已成为国内外研究热点，生物转化合成L-核糖具有立体选择性好、反应条件温和、污染少等特点。根据原料不同可分为两类：以核糖醇为原料和以L-阿拉伯糖为原料，其中值得提到的是近年来研究较多的以L-阿拉伯糖为原料转化为L-核糖需要二步催化,很多研究人员致力于将L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶两种酶作为一个酶催化体系,实现两种酶一步催化L-阿拉伯糖生产L-核糖。

随着基因工程技术的迅速发展，利用分子克隆和外源表达技术可以大幅度地提高某种工业酶在宿主微生物中的表达量，通过这种方法构建的基因工程菌株具有普通微生物难以企及的酶催化效率；利用共表达基因工程菌株生产L-核糖的工艺在国内尚没有报道，本发明选择自筛的发酵乳杆菌和嗜热栖热菌作为分子生物学操作的出发菌株，通过PCR技术从该菌株的基因组上扩增得到了L-阿拉伯糖异构酶的编码基因araA和甘露糖-6-磷酸异构酶的编码基因manA，利用大肠杆菌作为宿主，成功构建了能够高效共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种生产过程简单、条件适宜，能大幅度降低生产成本的基因工程菌。

本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌的构建方法。

本发明最后要解决的技术问题，是提供上述基因工程菌的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种外源共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶基因工程菌，其特征在于，其为导入了核苷酸序列SEQ ID NO：1（L-阿拉伯糖异构酶的基因序列，araA）和核苷酸序列SEQ ID NO：2（甘露糖-6-磷酸异构酶的基因序列，manA）的重组大肠杆菌。

上述基因工程菌的构建方法，它包括以下步骤：

（1）含有L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的表达载体的构建：

根据Genbank公布的来源于发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum，保藏号：CGMCC2921)和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus HB8,ATCC27634)的L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计下述引物：

araA-up：5’GGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG3’；

araA-down：5’GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT3’；

manA-up：5’ATATATCCATGGGTGGGGCCCCGGGTA3’；