[发明专利]一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌

权利要求书

1.一种共表达L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌，其特征在于，其为导入了核苷酸序列SEQ ID NO：1和核苷酸序列SEQ ID NO：2的重组大肠杆菌。

2.权利要求1所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，它包括以下步骤：

（1）含有L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的表达载体的构建：

根据Genbank公布的来源于发酵乳杆菌和嗜热栖热菌的L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的序列，运用Vector NTI软件设计下述引物：

araA-up：5’GGAATTCCATATGCGTAAGATGCAAG3’；

araA-down：5’GCGGTACCCTACTTGATGTTGAT3’；

manA-up：5’ATATATCCATGGGTGGGGCCCCGGGTA3’；

manA-down：5’AGAATTCTCACGCCCCCTCCTT3’；

分别提取处于对数生长期的发酵乳杆菌基因组DNA和嗜热栖热菌基因组DNA作为模板，进行PCR扩增，分别得到L-阿拉伯糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶基因的PCR扩增产物；回收所述L-阿拉伯糖异构酶基因和所述甘露糖-6-磷酸异构酶基因的PCR扩增产物，将L-阿拉伯糖异构酶基因经限制性内切酶Nde I和Kpn I双酶切，与经过同样双酶切的质粒pETDuet-01在T4连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pETDuet-araA；将重组质粒pETDuet-araA转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，然后涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

（2）经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取单克隆于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，获得L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌；

（3）对L-阿拉伯糖异构酶基因工程菌进行质粒提取：

对（1）中回收的甘露糖-6-磷酸异构酶基因用限制性内切酶Nco I和EcoR I双酶切，再与经过同样双酶切的质粒pETDuet-araA在T4连接酶的作用下进行连接，得到共表达质粒pETDuet-araA-manA；

（4）将共表达质粒pETDuet-araA-manA转化至宿主细胞中：

将共表达质粒pETDuet-araA-manA转化至感受态大肠杆菌BL21（DE3）中，涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12～16h得到单克隆；

（5）经抗性培养基筛选得到阳性克隆：

分别挑取单克隆于5mL含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养过夜，获得共表达L-阿拉伯糖异构酶和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌。

3.根据权利要求2所述的基因工程菌的构建方法，其特征在于，其中PCR扩增体系为：基因组DNA2μL，araA-up/manA-up和araA-down/manAdown各2μL，dNTP4μL，10×Taq缓冲液5μL，Taq酶1μL，ddH₂O34μL；

PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30s，然后55℃退火30s，72℃延伸2min，循环35次；最后72℃延伸10min。

4.权利要求1所述的基因工程菌在制备L-核糖中的应用。