[发明专利]一种有效改善重组蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及一种有效改善外源蛋白在大肠杆菌宿主中可溶性表达的方法。

背景技术

大肠杆菌表达系统是目前基因工程中最常用的重组蛋白表达系统.具有生长周期短、方法简便、构建快捷、表达水平高等优点，但由于大肠杆菌表达系统存在的缺陷，使所表达的蛋白常常易形成不溶性、无生物活性的包涵体。尽管可以通过后期变复性操作来获得蛋白的可溶性，过程复杂且收率低，显著增加了蛋白纯化的成本。为了获得有生物活性的重组蛋白表达产物，已有相关学者或研究人员摸索了许多方法来提高重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达，提供了分子伴侣蛋白质、二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等共表达方法或借助于金黄色葡萄球菌蛋白A、谷胱甘肽-S-转移酶、硫还原蛋白等融合标签可溶性表达或借助培养条件改变如降低诱导温度等方法，并已在生物工程、基因工程或分子生物学、遗传学等转基因表达中获得了大量应用，但对于一些蛋白而言，仍存在着过程复杂、操作繁琐、后期纯化成本高等问题。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种简单有效、可防止包涵体产物形成的方法，能够丰富和增强研究人员提高外源基因可溶性表达的手段，具有操作简便、生产成本低以及可规模放大的特点。

本发明采用以下技术方案：

1）种子活化：将-80℃冻存的重组蛋白大肠杆菌工程菌在无菌环境下按照0.1%的接种量及根据具体的宿主及载体情况加入相应量的抗生素，于36～38℃LB或其他培养基中150～220rpm摇床中培养过夜或12～14h。

2）发酵罐接种：在火焰保护下，按照1～10%的接种量接入种子液及加入相应量的抗生素进行菌体繁殖培养，温度32～38℃，pH控制在6.5～7.5，饱和溶氧浓度控制在10～50％。在后期可通过流加补料方式来延长发酵周期及提高菌体生长量。

3）诱导表达：当快要达到诱导阶段时，间断补料持续10～30分钟，通过含量测定确定培养基中C、N、P中的一种或数种限制性营养源消耗殆尽或低于控制水平之下时，开始进行温度变化或诱导剂添加等方式进行重组蛋白的诱导表达。后续通过控制营养源与其他补料成分分开流加的方式进行补料。此阶段维持2～36小时。注意其他营养源应按照菌体营养需求正常流加，中间可通过过程含量测定来改进配方。

4）收获菌体：5000 rpm离心5～20 min，去除上清，收集菌体，置于-20℃保存。

本方法主要通过后期控制与蛋白合成有关的营养源补料流加的方式来减慢蛋白合成的速度，从而改善重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达。

所述诱导表达阶段的补料可为合成培养基、半合成培养基、复合培养基，优选为全合成培养基,必要时可加入微量元素进行补充，如为半合成培养基、复合培养基，其天然有机物中所含的限制性营养源应注意在内。

所述诱导表达阶段的补料应与菌体生长阶段补料应间断一段时间，促使培养基中的限制性营养源耗尽或低于后期控制水平以下，间隔时间优选为10～30分钟，优选为采用含量检测来控制。

所述改善重组蛋白在大肠杆菌表达体系中可溶性表达的方法，可与其他已知的改善可溶性表达的方法如融合标签、分子伴侣以及培养条件改变等组合使用。

具体实施方式

结合具体实施例进行说明。

实施例1

菌株：E.coli IL10 BL21(DE3)PET15b 工程菌 (自主购建）；

培养基：LB液体培养基

摇瓶配制：按照LB配方（氯化钠 l0g/L，蛋白胨 l0g/L，酵母浸粉5g/L）， 将各种试剂称好后, 加入 相应量的三级水， 使其溶解并调节PH至7.0，分装摇瓶50ml /瓶（250ml），在高压灭菌锅内 121°C 20min灭菌。

10L发酵罐培养基配制：按照6L量根据LB配方称好各种试剂，加入相应量的三级水，加入发酵罐中，并采取在线灭菌的方式于121°C 20min灭菌后降温至37 ℃备用。

 菌体生长阶段补料配制：按照胰蛋白胨50 g/L，酵母浸粉25 g/L配制1升，混合后在高压灭菌锅内 121°C 20min灭菌后备用。

 菌体诱导表达阶段补料配制：按照葡萄糖100 g/L,配制500ml，硝酸铵50 g/L、3水磷酸氢二钾14 g/L，磷酸二氢钾5.2 g/L，混合配制500ml，在高压灭菌锅内 121°C 20min灭菌后备用。

一级种子制备：将-80°C冻存的重组蛋白大肠杆菌工程菌在无菌环境下按照0.1%的接种量及终浓度50ug/ml的卡那霉素，于LB培养基中37℃，200rpm培养过夜。