[发明专利]一种重组大肠杆菌利用甘油生产2,3-丁二醇的方法

说明书

技术领域：

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说将参与2，3-丁二醇生物合成的三个基因克隆并与大肠杆菌高拷贝载体pUC19连接，将重组质粒转入大肠杆菌中，使用氨苄青霉素作为筛选标记，以加强这三个基因在大肠杆菌中的表达量，使2，3-丁二醇可以在大肠杆菌中大量合成。 

背景技术：

2，3-丁二醇是重要的化工原料和液体燃料，广泛应用于化工、食品、燃料及航空航天等领域，可以用于生产塑胶，制备防冻剂，并且是一种很好的溶剂，易于转化为各种化合物生产橡胶，调味品以及化妆品(Syu M J.2001)。常温下是一种无色无味的透明液体，相对分子量为90.12g/mol，其分子式如下所示。上世纪中期，2，3-丁二醇的生物技术生产得到了迅速的发展，由于更为廉价的化学合成法的出现，使得生物技术生产2，3-丁二醇陷入困境。但是化学合成法使用石油作为原料生产2，3-丁二醇。最近二十年来，上升的石油价格导致化学合成法失去了优势，在能源需求不断扩大、化石能源日益短缺、石油资源供应不稳定的情况下，以可再生的生物质资源为原料，经过生物发酵的方法生产各种化学品、功能材料和能源物质的生物技术方法获得了人们的青睐。目前，研究热点都在于以糖质作为原料生产2，3-丁二醇，但是，粮食资源日益紧张的今天，开发以廉价的非粮糖质为原料发酵生产2，3-丁二醇具有很好的发展前景.(Xiu and Zeng2008) 

自然界很多微生物都可以生产2，3-丁二醇，目前用来发酵生产2，3-丁二醇的微生物主要为细菌类，包括克雷伯氏菌属(Klebsiella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)和沙雷氏菌属(Serratia)等(Garg S K.1995，Celinska E.2009，Soltys K A.2001)，其中克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属研究最为广泛。这些细菌利用碳源的种类、发酵生产2，3-丁二醇的产量、生成的2，3-丁二醇异构体均有差异，如克雷伯氏菌产生的meso-2,3-丁二醇占86％～95％，L-(+)-2，3-丁二醇占5％～14％，而Bacilluspolymyxa产生的D-(-)-2，3-丁二醇占98％以上，因此是研究制备手性2，3-丁二醇的热门菌株之一(De Mas C.1988)。此外，芽孢杆菌属具有产生淀粉酶和木聚糖酶的能力，可以直接利用淀粉类物质为底物，但其代谢产生副产物量较大，克雷伯氏菌虽然缺乏直接糖化淀粉的能力，但其底物使用范围较宽，如葡萄糖、木糖、果糖、阿拉伯糖、某些特定的二糖、糖醛酸等均可作为碳源，发酵较完全，对底物利用率高，且副产物较少，2，3-丁二醇产量较高，具有工业化生产的优势。但是由于粮食的短缺，导致以糖为底物的发酵生产前景堪忧，因此，我们使用了可以利用甘油的大肠杆菌作为生产菌株。大肠杆菌具有生物量较大，发酵周期短，生物背景明确，可以利用甘油这一非糖质底物等优点。由于现代工业在通过植物油和动物脂肪生产石油的过程中产生大量的废弃甘油，这些废弃甘油的比重高达10％，因此，使用大肠杆菌以甘油为底物生产2，3-丁二醇可以使原料成本降低，并且可以保护环境。 

发明内容

本发明的目的是获得一种使用甘油为底物高产2，3-丁二醇的大肠杆菌菌株的制备方法。本发明的另一目的是公开了高产2，3-丁二醇的基因工程菌的发酵方法。 

本发明以大肠杆菌BW25141(美国E.coli Genetic Resources at Yale，The Coli Genetic Stock Center)为出发菌株，将三个与合成2，3-丁二醇有关的基因通过大肠杆菌高拷贝载体pUC19(美国New England BioLabs公司)转入大肠杆菌中，从而获得高产2，3-丁二醇的基因工程菌BDO16156。得到的菌株可以用甘油作为碳源生产2，3-丁二醇。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的： 

一种使用甘油为底物高产2，3-丁二醇的大肠杆菌菌株的制备方法，其步骤如下： 

1)基因片段的克隆 

利用引物序列1 

GGGAAAGGTACCatgGACAAACAGTATCCGGTACGCC 

引物序列2 

GGGAAAGCATGCttaCAGAATCTGACTCAGATGCAGC 

PCR扩增基因片段alsS 

atgGACAAAC AGTATCCGGT ACGCCAGTGG GCGCACGGCG CCGATCTCGT CGTCAGTCAG