[发明专利]多级PCR检测莱姆病的方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物和检测领域，具体地，本发明涉及多级PCR检测莱姆病的方法和试剂盒及其应用。

背景技术

病原体导致人类或其他动物患病的主要原因。以HPV为例，人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。已知，人乳头瘤病毒(HPV)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。

HPV在99%宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。

该病原体(如病毒)的目前主要检测方法有：特异性PCR(Type-specific PCR)法：该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份PCR，则导致无法高通量的使用。

PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。

PCR技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。

随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量指数增加，因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。

DNA的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。

PCR技术具有广泛的生物学应用，包括例如，DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。

然而，在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。

在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。

此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。

莱姆病是一种常见的最普通的蜱类传播疾病，通过蜱叮咬人类皮肤传播。其病原体为伟氏包柔螺旋体(Borrelia burgdorefi)，在分类学上为螺旋体属的一种，它是一种单细胞的革兰氏阴性螺旋体，传播媒介为硬蜱。症状早期以慢性游走性红斑(ECM)为主，中期表现神经系统及心脏异常，晚期主要是关节炎。

目前本病的特异性诊断包括：血清学检查，如检测特异性抗体IgG和IgM等；和病原学检查，如直接检查和分离培养伯氏疏螺旋体、检测伯氏疏螺旋体独有的DNA序列等。然而，血清学试剂盒测试容易产生假阴性和假阳性结果。而传统的微生物学血培养技术则由于生长周期过长过慢，且病人临床表现千差万别，因此很难用于确诊。

利用PCR方法可以检测伟氏包柔螺旋体(B burgdorferi)DNA包括rRNA基因flaB,recA，p66和质粒携带的ospA基因，作为血清学评估的辅助手段，但这些方法敏感性低，不易确诊。

因此，本领域迫切需要开发一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的伟氏包柔螺旋体种类或型别的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的PCR反应设备和方法。

本发明的第一方面，提供了一种鉴别病原体种类或型别的方法，所述方法包括步骤：

(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；