[发明专利]多级PCR检测淋病奈瑟菌的方法和试剂盒

说明书

本发明公开了多级PCR检测淋病奈瑟菌的方法和试剂盒。本发明方法通过在全封闭体系中，用两对或多对所述病原体特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的病原体的核酸物质，并通过测序等方法准确地确定病原体的种类或型别。本发明方法实现了在全封闭体系内、可简便地在多级PCR过程中对各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，从而根本上消除了PCR的交叉干扰，使作为临床检测的极度灵敏的、但却又无法广泛实际应用的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

技术领域

本发明涉及生物和检测领域，具体地，本发明涉及多级PCR检测病原体的方法和试剂盒及其应用。

背景技术

PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。

PCR技术一般包括以下步骤：变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。

随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量指数增加，因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。

DNA的变性一般发生在约90-95℃，引物一般在约40-60℃退火至变性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75℃进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。

PCR技术具有广泛的生物学应用，包括例如，DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。

然而，在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系，如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。

在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。

此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检 测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。

淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，俗称淋球菌，为严格的人体寄生菌,淋病主要由性接触而传播。淋球菌侵入泌尿生殖系统繁殖，男性发生尿道炎，女性引起尿道炎和子宫颈炎。其主要的检测方法，一是通过细胞培养，在中性粒细胞中发现革兰氏阴性双球菌时，就有诊断价值，必要时进行分离培养。二是通过抗原检测法,包括直接荧光抗体法及酶免疫分析。然而，传统方法对低宫颈癌发病人群需做大量的阴道镜，且阳性预测值较低，常常导致漏检。更有甚者，大多数商业化的淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)核酸检测方法敏感性和专一性较低。由于淋球菌(Neisseria gonorrhoeae)有很高的遗传变异性和重组性，能够整合外源的DNA,也能够在不同类型之间进行DNA片段的交换，这样就造成一些试剂盒检测失败。比如：用基于cppB的PCR方法对缺失cppB基因的淋球菌感染人群进行检测，就得到了假阴性的结果。