[发明专利]一种用于检测猪流感病毒的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于动物卫生检验技术领域，特别是一种能够检测H1N1、H3N2、H1N2亚型猪流感病毒的LAMP引物组及制备的试剂盒。

背景技术

猪流感（Swine Influenza ,SI）是由猪流感病毒（Swine Influenza Virus ,SIV）引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病，临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难为特征。20世纪90年代中期，猪呼吸道疾病综合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）的发生和流行使得猪流感的危害更加突出。此外，由于猪是流感病毒基因重组或重配的“混合器”，是禽与人流感病毒基因重配的重要场所，因此该病还具有重要的公共卫生意义。

目前国内外报道的猪流感实验室诊断方法很多，在病原学诊断方法中主要有病原分离鉴定和RT-PCR等方法。2000年Notomi等首次报道环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification, LAMP)。该技术是一种新颖的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计特异性引物，在等温条件下（60～65℃）利用Bst链置换DNA聚合酶，高效、快速、特异性扩增靶序列。LAMP方法１h左右即可完成核酸扩增反应，其扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级，与传统PCR技术相比，该方法具有操作简单，快速灵敏，不需要特殊的仪器设备等优点。

目前，该方法在食品安全检测、流行性病毒检测、临床诊断，以及水产养殖等领域的应用及研究已有相关论文报道。 Enomoto及Kaneko等分别采用LAMP和聚合酶链反应(PCR)两种方法对与伪狂犬病毒同属的7型人类疱疹病毒进行DNA扩增，测得LAMP反应的灵敏性为每管250拷贝，较PCR的敏感性高10倍。wamodo等根据gyrB基因序列针对结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的特异引物和16S核糖体RNA保守序列的分枝杆菌属公共引物，用LAMP方法从痰标本中鉴定结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌，可检测到10个拷贝的细菌。在反应试管中加入SYBR Green I进行检测。如果含有扩增产物，反应混合物变绿；反之，则保持SYBR Green I的橙色不变。本专利依据LAMP技术的原理，针对猪流感病毒NP基因保守序列，通过各种条件的优化和筛选，设计出１组引物，可用于样品中猪流感病毒的检测。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于检测猪流感病毒的LAMP特异性引物组，其特征在于：

SIV-F3   GTCTCAAGGCACCAAACG        SEQ ID NO：1 

SIV-B3    AAAAGCAGAGAGCACCAT       SEQ ID NO：2 

SIV-FIP   ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT

SEQ ID NO：3 

SIV-BIP  GGTGGAATCGGAAGATTCTACATCTTTTTGCTATTTTGAATTAATCGTCCCT

SEQ ID NO：4

（1）它是针对猪流感病毒NP基因的保守区域设计的。

（2）可检测出H1N1、H3N2、H1N2亚型的猪流感病毒。

本发明的另一个目的是提供含有上述引物组的试剂盒。所述的试剂盒包括：

（1）LAMP反应液：

每22μL LAMP反应液中含有：2×Buffer（含Mg²⁺） 2.5μL；SIV-F3  0.5μL； SIV-B3  0.5μL；SIV-FIP 4μL；SIV-BIP 4μL；dNTPs 3.5μL；水7μL

   （2）8U/μL  Bst酶

（3）用于检测猪流感病毒的LAMP特异性引物组，其中的引物指的是：

SIV-F3    GTCTCAAGGCACCAAACG      SEQ ID NO：1 

SIV-B3    AAAAGCAGAGAGCACCAT       SEQ ID NO：2 

SIV-FIP   ACAGATGCTCTGATTTCTGTGGCTTTTTATCGTATGAACAAATGGAGACT

SEQ ID NO：3