[发明专利]一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞系，尤其是涉及一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法。

背景技术

目前，世界上已建立的细胞株和细胞系至少有数千种，包括人和动物的正常细胞、肿瘤细胞以及遗传缺陷型细胞等，其中，海洋生物的细胞培养晚于陆生生物。鱼类养殖业的迅猛发展也促进了鱼类细胞系的建立及其在病毒检测、疫苗和病理毒理方面的应用。鱼类细胞系建立始于20世纪60年代。1962年，Wolf等(WOLF K，QUIMBY M.Established eurythermic line of fish cells in vitro.Science1962.135:1065-1066.)首次建立了虹鳟生殖腺细胞系RTG-2，该细胞系在实验室传代培养至今。此后，鱼类细胞系培养发展迅速，至2010年,全世界已报道建立的鱼类细胞系约有275类,其中大多数来自淡水鱼或溯河产卵的海洋鱼类。淡水鱼类和溯河洄游性鱼类来源的细胞系约175株,分别来源于71个科的89种鱼类的不同组织;而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系仅有约100株,分别来源于23个科的35种海水鱼类的不同组织（张博，陈松林.近10年鱼类细胞培养研究进展及应用展望.Marine Sciences2011.35:113.）。

大黄鱼Pseudosciaena crocea（Richardson）俗称黄花鱼，属鲈形目石首鱼科黄鱼属，是我国特有的地方性种群，分布范围北起黄海南部，经东海、台湾海峡，南至南海雷州半岛以东。其肉质鲜嫩，是我国人民喜食的海产鱼，除供鲜食外还可加工制成风味和特色的水产品。此外，大黄鱼具有药用价值，其耳石具清热作用，鳔有润肺健脾、补气活血之功能。近年来，随着环境污染日益加剧和养殖业过度膨胀，大黄鱼病害问题日趋严重，各种传染性疾病频频暴发，造成大黄鱼死亡率逐年上升，经济损失严重，极大地影响了大黄鱼养殖业的健康发展。本发明利用大黄鱼重要免疫器官-头肾建立了能够在体外连续培养的细胞系，该细胞系目前在体外传至第70代以上，可用于大黄鱼免疫学及相关的细胞生物学、分子生物学研究。

发明内容

本发明的目的在于利用大黄鱼免疫组织—头肾，提供一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法。

本发明的另一目的在于提供一种大黄鱼头肾细胞系在分子免疫学、功能基因研究中的应用。

所述大黄鱼头肾细胞系为大黄鱼头肾细胞系LYCK，已于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013113，保藏中心地址为湖北省武汉市武汉大学。

所述大黄鱼头肾细胞系的构建方法，包括以下步骤：

1）配制细胞培养基；

2）原代培养的建立；

3）传代培养。

在步骤1）中，所述配制细胞培养基的方法可为：取GIBCO公司的L-15培养基粉末，溶解后，抽滤，分装，取少量做无菌测试，4℃保存，得基础培养基；临用前加入10%～20%的胎牛血清，双抗，于4℃保存，得完全培养基。

在步骤2）中，所述原代培养的建立方法可为：取3尾健康大黄鱼，量体长，称重，浸入75%的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；在事先备好的玻璃瓶中加入2mL含有2×双抗（青霉素200U/mL，链霉素0.2mg/mL）的L-15基础培养基，先剪断大黄鱼脊椎，依次分离大黄鱼的头肾组织，放入步骤1）所得到的基础培养基中清洗，至少漂洗3次，洗好后，在含上述基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块，糜状最好；去除基础培养基，加入2mL胰酶消化15～20min，再加入含20%FBS和2×双抗的L-15完全培养基终止消化反应；用无菌尼龙滤网过滤上述消化产物；1000～1500rpm离心10min，弃上清；加入L-15完全培养基重悬细胞沉淀，1000rpm再次离心10min，弃上清；加入完全培养基重悬细胞沉淀，并转至25cm²细胞培养瓶中，补加完全培养基至5mL，28℃细胞培养箱中静置培养。

在步骤3）中，所述传代培养的方法可为：细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化，显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜培养基制备细胞悬液，一分为二接种至两个培养瓶中，于28℃培养箱中培养。

本发明具有以下突出优点：

1、本发明建立的大黄鱼头肾细胞系形态为纤维状，该细胞系可以连续传代，大黄鱼头肾细胞系已传70代以上；能大量提供大黄鱼的头肾细胞系；该细胞系可以直接应用于各种大黄鱼免疫相关功能基因研究。