[发明专利]一种大黄鱼头肾细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种大黄鱼头肾细胞系，其特征在于为大黄鱼头肾细胞系LYCK，已于2013年8月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2013113。

2.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1）配制细胞培养基；

2）原代培养的建立；

3）传代培养。

3.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤1）中，所述配制细胞培养基的方法为：取GIBCO公司的L-15培养基粉末，溶解后，抽滤，分装，取少量做无菌测试，4℃保存，得基础培养基；临用前加入10%～20%的胎牛血清，双抗，于4℃保存，得完全培养基。

4.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤2）中，所述原代培养的建立方法为：取3尾健康大黄鱼，量体长，称重，浸入75%的乙醇中，进行体表消毒和麻醉，立即解剖；在事先备好的玻璃瓶中加入2mL含有2×双抗的L-15基础培养基，先剪断大黄鱼脊椎，依次分离大黄鱼的头肾组织，放入步骤1）所得到的基础培养基中清洗，至少漂洗3次，洗好后，在含基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块；去除基础培养基，加入2mL胰酶消化15～20min，再加入含20%FBS和2×双抗的L-15完全培养基终止消化反应；用无菌尼龙滤网过滤上述消化产物；1000～1500rpm离心10min，弃上清；加入L-15完全培养基重悬细胞沉淀，1000rpm再次离心10min，弃上清；加入完全培养基重悬细胞沉淀，并转至25cm²细胞培养瓶中，补加完全培养基至5mL，28℃细胞培养箱中静置培养；所述2×双抗为青霉素200U/mL和链霉素0.2mg/mL。

5.如权利要求4所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于所述在含基础培养基的玻璃瓶内将头肾组织剪成碎块后形成糜状。

6.如权利要求2所述一种大黄鱼头肾细胞系的构建方法，其特征在于在步骤3）中，所述传代培养的方法为：细胞长成单层后，吸出培养基，加入PBS漂洗细胞，加入含有0.25%EDTA的胰蛋白酶进行消化，显微镜观察下待细胞变圆即吸弃胰酶，加入新鲜培养基制备细胞悬液，一分为二接种至两个培养瓶中，于28℃培养箱中培养。

7.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系在各种大黄鱼免疫相关功能基因研究中的应用。

8.如权利要求1所述一种大黄鱼头肾细胞系在细胞生物学、分子生物学、病毒学、毒理学、肿瘤学、遗传学和免疫学研究中的应用。