[发明专利]高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术，尤其是一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法。

背景技术

谢瓦氏曲霉间型变种俗称“金花”菌，是茯砖茶发花过程中的优势菌种，其闭囊壳即“金花”数量决定着茯砖茶的品质(彭小赟，赵运林，何小书，雷存喜，刘石泉，周晓梅，董萌，胡志远 2011)。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的命名还存在争议，这可能是由于取材和鉴定方法的差异造成的(丁婷，吕嘉枥 2012; 胡治远，赵运林，刘石泉，李燕子，许永立 2012)，其中1990年刘作易等采用电镜的方法将“金花”菌鉴定为谢瓦氏曲霉间型变种(刘作易，秦京，王迺亮 1990)。茯砖茶是一种重要的“边销茶”，在西南和西北少数民族地区很受欢迎。谢瓦氏曲霉间型变种在茯砖茶上生长使茯砖茶具有一定的保健功能，主要体现在降脂减肥、促进消化、抗肿瘤功能和安全性可靠等方面(邓放明，龚舒莉，杨伟丽 2007; 黄群，陈林杰，李颜坡，车科 2007; 丁婷，吕嘉枥，侯蓓 2011; 袁勇 2011)。谢瓦氏曲霉间型变种在低渗条件下培养只产生子囊孢子，在高渗条件下培养只产生分生孢子，是研究丝状真菌有性繁殖和无性繁殖发生机制的良好材料(刘作易，秦京，李乃亮 1991)。因此，对谢瓦氏曲霉间型变种展开分子生物学研究既具有生产价值有具有理论意义。目前，谢瓦氏曲霉间型变种的分子生物学研究工作主要包括构建了根癌农杆菌介导的遗传转化体系和基因表达的差减文库以及产孢相关基因的克隆(马权，刘永翔，刘作易 2011; 王海，谭玉梅，刘永翔，王阶平，刘作易 2012; 谭玉梅，王海，刘永翔，刘作易 2013)。谢瓦氏曲霉间型变种有性产孢相关基因功能的研究工作以及全基因组和转录组测序工作已经开展。然而，较低的基因敲除效率阻碍了谢瓦氏曲霉间型变种的基因功能的研究工作。

作为外源DNA片段，基因敲除盒是通过DSBs修复机制整合到宿主细胞基因组上的。真核细胞的DSBs修复主要有两个途径：同源重组（homologous recombination，HR）和非同源末端交联（non-homologous end joining，NHEJ）。HR需要同源序列，当基因敲除盒通过HR途径整合到宿主细胞基因组上时便发生基因敲除。NHEJ不依赖同源序列，基因敲除盒通过NHEJ随机整合到宿主细胞基因组。一般认为，NHEJ与HR是竞争的，主要体现在Ku蛋白对HR的抑制(Krappmann 2007; Kass and Jasin 2010)。丝状真菌偏爱NHEJ途径，因此基因敲除效率较低。为提高HR的频率，得到较高的基因敲除效率，通常采用阻断NHEJ途径的策略，主要是敲除NHEJ途径的关键基因ku70或ku80。

发明内容

本发明的目的是：提供一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，通过本发明获得的工程菌株的基因敲除效率较高，能减少从大量转化子中获得基因敲除突变菌株的筛选工作。

本发明是这样实现的：高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，具体包括以下步骤：

步骤（1）：以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11扩增Ku70基因5’端DNA片段U；引物对P12的序列为5’-CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA-3’；引物对P13的序列为5’-TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT-3’；引物P10的序列为5’-CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC-3’；引物P11的序列为5’-CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC-3’；

步骤（2）：XbaⅠ和SacⅠ双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt-D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt-D-U，即为ku70基因敲除载体；