[发明专利]人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法

说明书

发明所属领域：

本发明属于疫苗技术领域，具体地的说，本发明涉及人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的人畜共患的自然疫源性疾病，是中国法定报告中死亡数和病死率最高的传染性疾病。据2003年世界狂犬病调查报告显示，中国的发病人数仅次于印度，居世界第二位，中国卫生部已将狂犬病列为2类传染病加以管理，但近年来中国狂犬病疫情一直呈上升趋势，疫情形势十分严峻。

目前世界大量生产的狂犬疫苗有二倍体细胞狂犬疫苗、Vero细胞灭活疫苗、地鼠肾细胞、鸡胚、鸭胚疫苗。实验已经证明，在人体试验中所使用的任何疫苗的免疫原性都无法和人二倍体细胞HDCV相比。人二倍体细胞为正常核型细胞，无致癌性，并且由于HDCV所具有的高免疫性和良好的耐受性，目前已经成为评价任何一种人用新疫苗的标准疫苗。HDCV的一个缺点是在HDCV上培养的狂犬病毒滴度相对较低，这使得疫苗的价格非常昂贵。

狂犬病毒在人二倍体细胞上培养毒种必须先在细胞上进行适应。国内外的相关研究机构均做了大量的适应实验，如US3397267（Mario V.Fernandes et.al）描述了CVS、PM、HEP毒株在WI-38上的适应方法，是通过用感染的细胞传代，在传代过程中逐渐加大未感染病毒的细胞比例，进行连续传代，使病毒连续适应于细胞中增殖，约需要30-40代后才能适应。在未适应二倍体细胞之前用病毒悬液加正常细胞传代，其病毒滴度约为3.02logLD₅₀/ml，而通过带毒细胞传代后，其滴度可达7.0logLD₅₀/ml。我国中检所严子林等人采用相同的方法，用适应小鼠的狂犬固定毒CTN鼠脑悬液在KMB-17上适应，37代以前主要用带毒细胞加正常细胞混合后进行传代，37代后用病毒悬液加正常细胞传代。病毒滴度变化，2代1.0，4代1.56，14代1.98，26代3.17，37-38代4.5，39-40代3.5-4.0，41-50代4.5-6.33，51-106代，2个代次为6.16-6.23，34个代次为4.5-5.5，15个代次为3.9-4.33，大部分代次在4.5-5.5/0.03ml之间，40代后CTN鼠脑病毒适应人二倍体细胞。浙江普康生物技术股份有限公司毛子安等人，将狂犬病毒固定毒CTN-1V5株连续在KMB-17中传代，并以终末稀释法筛选出滴度较高的病毒，病毒滴度由第1代的4.5logLD₅₀/ml逐渐升高，到20代时病毒滴度≥6.9logLD₅₀/ml，传代至47代病毒滴度基本稳定在7.0logLD₅₀/ml。

以上这些方法均采用带毒传代并且需逐渐加大新鲜细胞的方法进行，需传代40代以上才能适应，耗时太长，且滴度较低。

发明内容：

本发明的目的是克服现有工艺存在的不足之处，提供一种人用狂犬病病毒株在人二倍体细胞的快速适应方法，缩短病毒的适应周期，在不影响病毒免疫原性的前提下快速提高病毒产量，节约人力物力。

为达到上述目的，本发明公开了一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤：

1)将新鲜狂犬病毒按0.0001-1MOI接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30-40℃吸附30-90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30-40℃培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒P1代；

2)带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；

3)再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；

4)接种步骤3）收获的病毒，重复步骤1），2），3），为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。

在本发明中，所述的人胚肺二倍体细胞为WI-38或MRC-5或KMB-17或Walvax-2，CCTCC C201055。优选为人胚肺二倍体细胞Walvax-2，CCTCC C201055。