[发明专利]人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的快速适应方法有效
| 申请号： | 201310463715.6 | 申请日： | 2013-10-08 |
| 公开（公告）号： | CN103468649A | 公开（公告）日： | 2013-12-25 |
| 发明（设计）人： | 杨喆;马波;何丽芳;王丽丽;李伟;陈敏;王馨;尹孝兵 | 申请（专利权）人： | 云南沃森生物技术股份有限公司 |
| 主分类号： | C12N7/00 | 分类号： | C12N7/00 |
| 代理公司： | 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 | 代理人： | 张火春 |
| 地址： | 650106 云南省昆明*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 狂犬 疫苗 二倍 体细胞 快速 适应 方法 | ||
1.一种人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤：
1）将新鲜狂犬病毒按0.0001-1MOI接种入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞悬液中，在30-40℃吸附30-90分钟，补加细胞培养液至合适体积，30-40℃培养，2-5天成致密单层，弃细胞培养液，换病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒P1代；
2）带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；
3）再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，30-40℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；
接种步骤3）收获的病毒，重复步骤1），2），3），为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
2.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中人胚肺二倍体细胞为WI-38或MRC-5或KMB-17或Walvax-2，CCTCC C201055。
3.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中人胚肺二倍体细胞Walvax-2，CCTCC C201055。
4.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，病毒在36℃吸附细胞60分钟。
5.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，感染细胞在36℃培养，3-5天成致密单层。
6.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，所使用的细胞培养液为含5%-20%牛血清的MEM培养液。
7.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，病毒维持液是含5%牛血清和1%蔗糖的MEM培养液。
8. 根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株或aG株或PM株。
9.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，其中，人用狂犬疫苗毒种为CTN-1V5株。
10.根据权利要求1中所述的人用狂犬疫苗毒种在人二倍体细胞上的适应方法，该方法包括下列步骤：
1）将新鲜狂犬病毒CTN-1V5株按0.01MOI接种病毒入分散为单个细胞的人胚肺二倍体细胞Walvax-2悬液中，在36℃吸附60分钟，补加细胞培养液至合适体积，36℃培养，4- 5天成致密单层，弃细胞培养液，换含5%牛血清和1%蔗糖的MEM病毒维持液，再培养3-7天，收获培养上清液，补加5-30%牛血清置低温冻存，并标为人二倍体细胞培养病毒P1代；
2）带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P2代；
3）再次带毒细胞消化传代，依1:1-1:3的传代比率传代，生长2-5天细胞成致密单层后换病毒维持液，36℃培养3-7天，收获上清冻存，标为人二倍体细胞培养病毒P3代；
4）接种步骤3）收获的病毒，重复步骤1），2），3），为一个循环，经过4-5个循环，获得对人二倍体细胞敏感的狂犬疫苗毒种。
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