[发明专利]D‑叔亮氨酸的一种生物催化制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一种生物催化剂内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶变体，利用该生物催化剂以α-酮酸为底物还原氨化合成光学纯D-叔亮氨酸。

背景技术

氨基酸是指既含有氨基的羧酸的有机化合物，不同氨基酸的之间区别在于它们侧链R基团的不同，自然界中到目前为止共发现有300多种氨基酸，根据是否是构成天然蛋白质的基本组成成分，氨基酸可分为天然氨基酸和非天然氨基酸，非天然氨基酸是指人工合成的各种氨基酸。除甘氨酸外，氨基酸都有不对称碳原子，呈旋光性，根据空间排列位置不同，可以分为D-氨基酸和L-氨基酸两种，不同旋光氨基酸在生物体内发挥着不同的生理作用。叔亮氨酸是一类非天然氨基酸，其侧链为大位阻疏水性叔丁基，而且在空间上很接近氨基和羧基，含有叔亮氨酸的肽键很难被降解，因而增加了相关化合物酶解稳定性，由于大位阻能很好的控制分子构象，这些特征使得叔亮氨酸成为重要的医药中间体和不对称合成的手性诱导模板及催化剂【Bommarius，A.S.，et.al(1995).Tetrahedron：Asymmetry6(12)：2851-2888】。

合成光学纯氨基酸的方法主要有：外消旋体拆分法、化学合成法及生物法的化学和生物合成法。近年来生物法，尤其是酶法转化以其无污染、成本低、产物光学纯度高的特点已经显示出广阔的市场前景。在叔亮氨酸酶法合成方面，L-叔亮氨酸的合成主要是通过氨基酰化酶拆分【连续化酶法生产L-叔亮氨酸，专利号：201010622182】，以及L-亮氨酸脱氢酶还原氨化进行【Hummel，W.，et.al(2003).Org Lett5(20)：3649-3650；Menzel，A.，et.al(2004).Engineering in Life Sciences4(6)：573-576】。而且已应用于生产【一种制备L-叔亮氨酸的方法，专利号：201110202325；一种L-叔亮氨酸的生产方法，专利申请号：2012105080840】。D-叔亮氨酸可以通过一些酶法进行合成，如青霉素酰化酶【Liu，S.L.，et.al(2006).Prep BiochemBiotechnol36(3)：235-241】、D-海因酶【Turner，R.J.，et.al(2004).Engineering in Life Sciences4(6)：517-520】、腈水合酶/D-酰胺酶【Marion Ansorge，et.al(2003).EP patent application1，318，193)、蛋白酶【Laumen，K.，et.al(2001).Biosci Biotechnol Biochem65(9)：1977-1980】等，但这些合成方法是对消旋体进行拆分，最高理论产量为50％。氨基酸脱氢酶(EC1.4.1.X)能在辅酶NAD(P)⁺的存在下，催化氨基酸可逆氧化脱氨/还原氨化反应【Ohshima，T.et.al(1990).Adv Biochem Eng Biotechnol42：187-209】，能被用来从酮酸底物出发，利用NH₃作为氨基供体合成氨基酸，其副产物是水，而且产物对映体理理论产率为100％，从经济成本和对环境影响方面考虑，该方法是合成氨基酸的绿色经济的方法【Zhu，D.et.al(2009).Biotechnol J4(10)：1420-1431】。已报道的野生型氨基酸脱氢酶多为L-选择性的【Yonaha，K.et.al(1986).AdvBiochem Eng Biotechnol33：95-130】，许多酶被成功用于工业规模生产L-氨基酸【Ohshima dt.al(1990)Bioprocesses and Applied Enzymology，Springer Berlin/Heidelberg.42：187-209；Galkin，et.al(1997).Appl Environ Microbiol63(12)：4651-4656】。目前没有野生型的D-氨基酸脱氢酶可以用来还原氨化生成D-氨基酸。内消旋-二氨基庚二酸脱氢酶，(DAPDH，EC1.4.1.16)可逆催化二氨基庚二酸D-构型氨基的氧化脱氨/还原氨化，该酶的突变体已经被用来以酮酸为底物，选择性合成D-氨基酸【Vedha-Peters，et.al(2006).J Am Chem Soc128(33)：10923-10929；Akita，H.，et.al(2012).Biotechnol Lett34(9)：1693-1699；Akita，H.，et.al(2013).Appl MicrobiolBiotechnol.1-9】，但是这些报道中的酶均不能合成D-叔亮氨酸，至今也没有利用氨基酸脱氢酶还原氨化合成D-叔亮氨酸的相关文献报道。