[发明专利]PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明属于动物分子生物学和基因工程领域，涉及一种PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建及应用。 

背景技术

围产期奶牛脂肪肝是因围产期奶牛能量负平衡导致的代谢性疾病，但因没有有效的防治措施给养牛业带来了巨大的损失，寻找一种有效的治疗方法迫在眉睫。鉴于围产期奶牛（特别是荷斯坦品种奶牛）肝脏氧化脂肪酸的能力弱，合成和分泌脂蛋白能力不足是脂肪肝发生的主要环节，建立调控肝脏脂肪酸氧化和VLDL分泌与合成的基因疗法，或许能为围产期奶牛脂肪肝的防治提供新思路。 

磷酸酶张力蛋白同系物（Phosphoatase and tensin homolog，PTEN）是迄今发现的第一个具有双重特性磷酸酶活性的肿瘤抑制基因，通过对细胞内多条信号转导通路的负性调控，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导肿瘤细胞凋亡，对维持细胞的正常生理活动发挥重要作用。PTEN的抑癌功能一直是肿瘤发生发展中的研究热点。然而，近来越来越多的研究发现：PTEN通过其脂质磷酸酶、蛋白磷酸酶及其不依赖于磷酸酶的生物活性，在脂肪肝脏的发生和发展方面发挥着重要的作用。 

最近几年，对PTEN基因及其蛋白的研究已经延伸至其他领域，而不再仅仅局限于肿瘤。肝脏是机体内重要的新陈代谢器官，在正常机体内，PTEN基因及其蛋白有相对较高的表达。PTEN基因及其蛋白的异常表达除了会在肝细胞癌中出现，也在其他肝脏疾病发生的重要调节。 

分子生物学技术，在研究生物学功能和疾病治疗等方面发挥着重要的作用。目前存在腺病毒、逆转录病毒和慢病毒等基因传递载体系统，每种载体都有它特有的优势和缺点。腺病毒对大多数细胞，包括分裂和不分裂细胞及原代细胞都具有感染效率，感染效率几乎能达到100%，同时它携带进入宿主细胞内的基因不会不整合到宿主细胞，不干扰宿主细胞基因的表达。但腺病毒也具有自身的缺点，主要是进行重组腺病毒的构建和包装步骤比较繁琐，要求的也比较高，操作起来较其他两种载体系统要复杂的多。而逆转录病毒与腺病毒相比，对细胞的转染效率要差的很多，对大多数细胞种类的的感染效率都比较低，一般都不超过30%，从而影响实验效果，尤其是本实验使用的原代培养的肝细胞转染效果会更差。同时慢病毒的转染效率还依赖细胞的分裂，而本实验的肝细胞是原代的并且没有分裂功能，所以更加不适用。另外逆转录病毒载体 也有自身的缺点，主要是它会将转入的外源性基因整合到宿主细胞的基因组上，引起宿主细胞内的基因突变、甚至有激活癌基因的风险，一旦发生突变可能会对宿主细胞造成极大的破坏和损伤。但从它的构建及包装来说，要比腺病毒操作程序要简单很多，易于操作。第三种载体传递系统慢病毒也是实验研究中常用的一种基因载体传递系统，就转染效率而言，基本介于腺病毒和逆转录病毒载体传递系统之间，感染效率能够达到30%以上。但慢病毒载体传递系统的缺点与逆转录病毒相类似，它也能将转入的外源性基因整合到宿主细胞基因组上，对宿主细胞基因表达具有一定的风险，可能会造成基因突变、癌变等。但慢病毒传递系统的构建和包装步骤不是很繁琐，易于操作。 

腺病毒是一种无包膜双链DNA的动物病毒。基因组大小约为36kb，常用于研究DNA复制、转录和作为基因工程载体。上世纪50年代发现了腺病毒，一共有100余种血清型。能感染多种组织和器官，包括肝脏、尿道和膀胱、呼吸道、胃肠道和眼等。腺病毒感染细胞的过程是从腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体开始的，与脂质体转染质粒进入细胞相比，腺病毒基因组进入细胞核的效率要高出很多，一般可以达到40%以上，尤其是进入细胞核的效率是脂质体的1000倍。 

腺病毒载体可广泛的用于哺乳动物的基因表达，在很多组织中都能表达重组蛋白，被广泛的应用于体外基因转导、基因治疗和体内接种疫苗等各个领域。腺病毒对许多哺乳动物细胞都比较易感，能够转染的细胞种类也比较多，无论是细胞系，还是原代培养的贴壁细胞，亦或是常规转染试剂难以转染的细胞类型，腺病毒都能够很好转染效率，与质粒转染相比，具有瞬时转染基因转移效率更高的优点。同时腺病毒系统具有高效、安全、生产周期短、病毒滴度高、易于浓缩及贮存等优点。因此，可以考虑将PTEN基因的mRNA构建入腺病毒载体，用于目的基因的过表达，研究PTEN基因在奶牛脂肪肝中所起的作用。 

发明内容

本发明的目的是提供一种PTEN基因的mRNA，用于构建过表达重组腺病毒载体。 

本发明的第二个目的是提供PTEN基因过表达重组腺病毒载体，能够使得目的基因过表达。 

本发明的第三个目的是提供上述PTEN基因过表达重组腺病毒载体的构建方法。