[发明专利]人正常支气管上皮细胞及其原代分离培养和传代培养方法与用途

权利要求书

1.一种人正常支气管上皮细胞，其特征在于：分类命名为人正常支气管上皮细胞HNBEC/HL-001，保藏编号为CCTCC NO：C201311。

2.根据权利要求1所述的人正常支气管上皮细胞，其特征在于：染色体为二倍体，短串联重复序列基因型以16个短串联重复序列基因座/等位基因长度来表示：AMEL/X/Y，D3S1358/17，TH01/7/8，D21S11/31/32，D18S51/20，Penta E/11，D5S818/11/12，D13S317/8/11，D7S820/8/13，D16S539/11，CSF1PO/10/12，Penta D/7/13，WA /17，D8S1179/15/16，TPOX/8/11，FGA/20/24。

3.根据权利要求1所述的人正常支气管上皮细胞，其特征在于：用HL培养基于37℃、5% CO₂培养；所述的HL培养基为：DMEM与无血清培养基SFM按体积比1 : 3混合，同时添加5%的胎牛血清，以及0.4 μg/mL皮质醇，5 μg/mL胰岛素，8.4 ng/mL霍乱毒素，10 ng/mL表皮生长因子，24 μg/mL腺嘌呤，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素，0.25 μg/mL两性霉素B，30 μM法舒地尔。

4.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）收集肺癌患者手术切除的癌旁正常组织样品；

（2）用95～100%的乙醇洗分离的组织样品，再用PBS洗，然后将组织样品放入含预冷PBS的无菌培养皿中，在解剖显微镜下，用解剖镊子和剪刀去除组织样品中残留的脂肪；

（3）将组织样品用消化液消化；所述的消化液为含胶原酶和分散酶的 HL培养基；

（4）消化后的组织离心去上清，将细胞沉淀重悬于0.25%胰酶-EDTA中消化；

（5）加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基，离心去上清；

（6）加入温水浴的分散酶和DNase I，用枪头反复吹打样品；

（7）再加入含10% 胎牛血清的DMEM培养基，用40～70 μm孔径的过滤器过滤细胞悬液，收集过滤后的细胞悬液，离心去上清；

（8）重悬细胞沉淀于HL培养基中，接种于培养瓶培养，得到人正常支气管上皮细胞。

5.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的预冷为在冰上预冷；

步骤（3）中所述的消化液的用量为10倍于组织样品体积，所述的的消化的条件为37℃消化1～3小时；

步骤（3）中所述的胶原酶和分散酶的浓度均为0.2 mg/mL。

6.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（4）中所述的消化为冰上消化1小时或室温消化10分钟；

步骤（6）中所述的温水浴为37℃的温水浴；

步骤（8）中所述的培养的条件为37℃、5% CO₂。

7.根据权利要求4所述的人正常支气管上皮细胞的原代分离培养方法，其特征在于：

步骤（4）、（5）、（7）中所述的离心为1000 rpm离心5分钟。

8.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞的传代培养方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）当人正常支气管上皮细胞增殖至70～90%丰度时，用PBS洗涤细胞，再用0.05%胰酶-EDTA消化单层细胞；

（2）加入DMEM中和消化反应；离心去上清，用HL培养基重悬细胞沉淀，接种于培养瓶培养。

9.根据权利要求8所述的人正常支气管上皮细胞的传代培养方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的消化的时间为2～5分钟；

步骤（2）中所述的离心为1000 rpm离心5分钟，所述的培养的条件为37℃、5% CO₂。

10.权利要求1-3任一项所述的人正常支气管上皮细胞在人正常细胞的生理学研究、体外正常细胞的药物毒性研究和检测、支气管和肺相关疾病包括支气管肺癌的发病机理研究中的应用。