[发明专利]一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建。

背景技术

肌生成抑制素(Myostatin，MSTN)是肌肉生长的一种负调控因子，隶属于TGF-β超家族，具有TGF-β超家族所有特点。

MSTN突变产生的双肌现象给畜牧生产和医药业带来巨大影响。Mcpherron研究发现该基因缺失鼠肌肉增大，骨骼肌肌群分布更广泛，体重约是野生鼠的2倍以上。Kambadur发现双肌牛的该基因发生了突变，在同样喂食条件下，双肌牛比普通牛可以多提供30％的肉产品。

2011年，zhang等发现小鼠口服表达MSTN的酵母，能产生高水平的MSTN特异性抗体，该抗体可以解除MSTN基因对肌肉生长的抑制，进而提高的胴体重和肌肉生长。

但采用非整合质粒表达载体的长期扩繁会造成携带目的基因质粒的丢失，且需要筛选培养基选择压的持续抗性筛选，成本高，操作复杂，不适合大规模的工业化生产。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，旨在解决目前采用非整合质粒表达载体的长期扩繁会造成携带目的基因质粒的丢失，且需要筛选培养基选择压的持续抗性筛选，成本高，操作复杂，不适合大规模的工业化生产的问题。

本发明是这样实现的，一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，该可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法包括以下步骤：

步骤一、KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建；

步骤二、酵母基因同源臂的插入；

步骤三、pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建；

步骤四、将MSTN载体整合入酵母基因组；

步骤五、抗性基因KanMX4的敲除。

进一步，步骤一KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建具体步骤为：

设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段；

在引物两段添加LoxP序列和EcoRI，BamHI两个酶切位点，把KanMX4基因片段在酵母基因组中扩增出来，PCR程序：①预变性：94℃3m；②20Cycle，变性94℃1m；退火45℃30s；延伸72℃2m；③延伸72℃5m；④4℃forever；

PCR后进行溶液回收，用EcoRI和BamHI进行双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳上跑胶，胶回收酶切产物获得较纯的片段，用同样的酶双酶切pBluescript II SK+，再将两个片段在16℃过夜连接；

将获得的连接产物在大肠杆菌中转化，转化成功后挑选其中的单克隆提取细菌质粒，首先用BamHI和EcoRI双酶切，跑1％的琼脂凝胶电泳确定酶切片段的长度，初步判断是否为阳性质粒，并测序鉴定质粒是否成功转化。

进一步，步骤二通过酵母基因组同源臂的插入具体步骤为：

在酵母基因组的non-transcriptional space2即NST2片段中设计NST2-5’端和NST2-3’端两个同源臂的四个引物；

在NTS2-5’引物中插入XhoI和KpnI两个限制性内切酶的酶切位点；

在NTS2-3’引物中插入NotI,和SacII两个限制性内切酶的酶切位点；

将NTS2-5’R和NTS2-5’F两条引物加入PCR缓冲液中，94℃室温下冷却5min，直接得到了同源臂NTS2-5’，用XhoI和KpnI分别双酶切NTS2-5’同源臂和pBlue-kan，再分别胶回收两部分进行连接，连接产物转化到大肠杆菌中，转化成功后，挑选其中的单克隆提取细菌质粒PCR鉴定，测序进一步确定，用相同的方法将NTS2-3’同源臂插入进来，最终得到pBlue-kan-NTS5’3’载体。

进一步，步骤三pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建的具体步骤为：

从JMB667中扩增出ADH1启动子和Cyc3终止子，从pET32a-MSTN中扩增出MSTN基因；

将三部分分别胶回收纯化，设计引物用overlap PCR的方法连接ADH1启动子，Cyc3终止子和MSTN基因，组装成2890bp的MSTN基因片段；