[发明专利]一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法

权利要求书

1.一种可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，该可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法包括以下步骤：

步骤一、KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建；

步骤二、酵母基因同源臂的插入；

步骤三、pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建；

步骤四、将MSTN载体整合入酵母基因组；

步骤五、抗性基因KanMX4的敲除。

2.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤一KanMX4基因片段的扩增和pBlue-KanMX4载体的构建具体步骤为：

设计引物LoxP-Kan F，LoxP-Kan R在提取到的酵母基因组中扩增KanMX4基因片段；

在引物两段添加LoxP序列和EcoRI，BamHI两个酶切位点，把KanMX4基因片段在酵母基因组中扩增出来，PCR程序：①预变性：94℃3m；②20Cycle，变性94℃1m；退火45℃30s；延伸72℃2m；③延伸72℃5m；④4℃forever；

PCR后进行溶液回收，用EcoRI和BamHI进行双酶切，在1％琼脂糖凝胶电泳上跑胶，胶回收酶切产物获得较纯的片段，用同样的酶双酶切pBluescript II SK+，再将两个片段在16℃过夜连接；

将获得的连接产物在大肠杆菌中转化，转化成功后挑选其中的单克隆提取细菌质粒，首先用BamHI和EcoRI双酶切，跑1％的琼脂凝胶电泳确定酶切片段的长度，初步判断是否为阳性质粒，并测序鉴定质粒是否成功转化。

3.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤二通过酵母基因组同源臂的插入具体步骤为：

在酵母基因组的non-transcriptional space2即NST2片段中设计NST2-5’端和NST2-3’端两个同源臂的四个引物；

在NTS2-5’引物中插入XhoI和KpnI两个限制性内切酶的酶切位点；

在NTS2-3’引物中插入NotI,和SacII两个限制性内切酶的酶切位点；

将NTS2-5’R和NTS2-5’F两条引物加入PCR缓冲液中，94℃室温下冷却5min，直接得到了同源臂NTS2-5’，用XhoI和KpnI分别双酶切NTS2-5’同源臂和pBlue-kan，再分别胶回收两部分进行连接，连接产物转化到大肠杆菌中，转化成功后，挑选其中的单克隆提取细菌质粒PCR鉴定，测序进一步确定，用相同的方法将NTS2-3’同源臂插入进来，最终得到pBlue-kan-NTS5’3’载体。

4.如权利要求1所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤三pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建的具体步骤为：

从JMB667中扩增出ADH1启动子和Cyc3终止子，从pET32a-MSTN中扩增出MSTN基因；

将三部分分别胶回收纯化，设计引物用overlap PCR的方法连接ADH1启动子，Cyc3终止子和MSTN基因，组装成2890bp的MSTN基因片段；

PCR后进行胶回收，再用Xho I和EcoR I进行双酶切，用同样的酶双酶切pBlue-kan-NTS5’3’载体，再进行两部分的连接，将连接产物转化到大肠杆菌中，得到MSTN整合载体pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN；

挑取转化的单克隆提取质粒，用酶切法初步鉴定，并进行测序。

5.如权利要求4所述的可用于大规模生产的MSTN酵母菌种的构建方法，其特征在于，步骤三pBlue-kan-NTS2-5’3'-MSTN整合载体的构建中在做Overlap PCR时，首先扩增MSTN和Cyc-3两部分；

连接ADH1、MSTN、Cyc-3三部分，首先要做个Pool；

PCR程序：①预变性：94℃3m；②8Cycle变性94℃1m；退火45℃30s；延伸72℃2m；③延伸72℃5m；④4℃forever；

PCR程序完成后再加入引物ADH1和Cyc-3各1ul，继续程序：①预变性：94℃3m；②20Cycle，变性94℃1m；退火45℃30s；延伸72℃3m；③延伸72℃5m；④4℃forever。