[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合征复合活疫苗的制备方法。

背景技术

猪蓝耳病又称猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS），是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的，以妊娠母猪发生早产、流产、产死胎、弱仔和木乃伊胎，仔猪和育肥猪发生呼吸道症状的疾病。PRRS难以有效的防制，首先是PRRSV以肺巨噬细胞为靶细胞，具有抗体依赖性增强作用（ADE）造成了一定的免疫抑制，其次是PRRSV不断的发生着变异，并且PRRS没有有效的治疗药物，免疫接种是目前控制该病的最主要措施。

灭活苗以其不会返强，不散毒而普遍用于免疫猪只，但是灭活疫苗采用全病毒包被，不可避免存在的异体蛋白，易引起变态反应，另外免疫需要剂量大，次数多，家畜免疫注射后应激反应较大，免疫抗体产生需要的时间长，免疫效果不是很明显。研究者对国产灭活疫苗进行了比较，发现部分国产灭活疫苗副反应较大，抗体最早产生时间不稳定，且维持时间短，国产灭活疫苗还不能提供稳定有效的保护。

与灭活疫苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫反应持续时间长且更有效，且弱毒苗产生抗体快速，能激活细胞免疫和体液免疫。弱毒疫苗可在猪体内复制，能引发更好的免疫效果，可以持续刺激猪体的免疫应答，以抵御病毒入侵，所以保护时间长，同时弱毒疫苗的免疫量要比灭活疫苗低，在减少副反应的同时也降低了生产成本。研究证明弱毒疫苗的交叉保护能力要优于灭活疫苗。因此，目前在暂时没有更好替代方法防控PRRS的情况下，PRRS弱毒疫苗对于防控PRRS爆发有积极的作用。但是普遍认为弱毒疫苗在安全方面存在不足，究其原因主要是因为蓝耳病病毒易发生变异，故选择优异的弱毒疫苗毒株显得尤为重要。目前，PRRSV在我国的流行特点总体上来说是以美洲型毒株为主，PRRSV经典毒株在我国各地依然流行，其造成的危害仍然存在。然而近年来我国高致病性蓝耳病频发，同时也混合着经典蓝耳病给蓝耳病的防制工作带来了困难。研究者通过系统进化树分析得知我国高致病性变异株与CH-1a具有较近的亲缘关系，有学者认为CH-1a在蓝耳病病毒从经典毒株演变到高致病性毒株的过程中充当了过度的角色。弱毒疫苗株CH-1R正是由CH-1a株驯化而来的，因此采用CH-1R制备的弱毒疫苗针对我国现流行的蓝耳病具有更强的交叉保护能力。

目前为止，蓝耳病疫苗生产主要还是通过转瓶培养单层细胞，接种蓝耳病病毒后获得病毒悬液，进而制备成蓝耳病疫苗。因转瓶培养法劳动强度大，占地空间大，单位体积提供细胞生长的表面积小，细胞生长密度低，培养时监测和控制环境条件受限制等很大程度上影响了蓝耳病疫苗的产量，同时也导致了疫苗批次之间的不稳定性。为了克服现有PRRS弱毒疫苗生产技术所存在的缺陷，寻找简便、高效的病毒株以及其合适的生长培养条件对提高疫苗质量、降低生产成本具有重大意义。

近年来，生物反应器和微载体技术培养细胞、繁殖病毒在生物制药行业应用广泛。与传统转瓶培养工艺相比，悬浮培养技术有着巨大的优势：首先单位体积内有效工作细胞数量增加；其次全密闭、管道化系统生产流程及过程自动化监控、控制技术，不仅减少了污染细胞的机会，而且在减轻劳动强度的同时减少人为操作因素影响；再者生物反应器容积的扩大，提高了产品的均一性，也提高了产品的产量和质量；最后生产疫苗所用的成本远低于传统转瓶培养工艺，综合成本大大降低。我国的生物反应器悬浮培养技术起步较晚，但近几年该技术的在国内的发展非常快。目前国内已有部分发明专利采用不同生物反应器系统和不同类型微载体进行蓝耳病疫苗的研制，但应用激流灌注式生物反应器-聚酯纤维纸片载体生产猪繁殖与呼吸综合征活疫苗（CH-1R株），尚未见报道。

抗原抗体复合物疫苗是上世纪90年代发展起来的一种新型疫苗，由特异性高免血清按照适当比例与抗原混合而成。抗原抗体复合物疫苗中抗体主要起着延缓病毒释放的作用，疫苗注射后，免疫复合物会被存在于脾脏的一种称为树突状淋巴细胞所捕获，继而抗原会缓慢释放。当母源抗体下降到疫苗可以出破的水平时，此时释放的疫苗抗原即可在靶器官定植，从而诱导免疫力。其优点在于安全性高，免疫效果比常规疫苗好；可突破母源抗体干扰，仔猪使用该类疫苗对其他疫苗免疫无干扰作用。

传统的抗原抗体复合物疫苗制作方法是将高免血清与法氏囊病毒结合，该方法制备疫苗所需大量高免血清抗体，需通过屠杀大量动物获得，费时费力，同时生产成本较高，导致疫苗价格较昂贵。