[发明专利]一种降低野生型人鼠杂交瘤AL细胞自发突变背景的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种哺乳动物细胞突变检测技术领域，尤其涉及的是一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法。

背景技术

基因突变不仅是癌症发生的关键因素之一，而且是环境污染物遗传毒性评价的重要依据。A_L细胞是中国仓鼠CHO细胞gly^-A突变株与正常人成纤维细胞杂交后所得永生化细胞，含有一整套中国仓鼠CHO-K1染色体和一条人的11号染色体。人的11号染色体可编码多种细胞表面蛋白，其中包括CD59基因（旧称为MIC1基因）编码的CD59细胞表面抗原（旧称为S1抗原）。由于野生型A_L细胞CD59基因正常表达时在细胞表面形成CD59抗原，在兔血清补体存在的情况下，该抗原与特异性抗体E7.1结合后，导致野生型细胞裂解而无法生存；而突变细胞因不能表达CD59蛋白，无法与抗体和补体作用而得以存活，在培养皿上形成肉眼可见的突变细胞克隆。根据这一特点，A_L细胞已被广泛用于环境污染物如氡气、石棉、有机污染物、重金属等遗传毒性检测及相关机理研究。

然而，在连续传代过程中，野生型A_L细胞的自发突变细胞会不断增加，导致自发突变背景上升，基因突变检测的灵敏度下降，为了克服这一现象，在突变实验前，野生型A_L细胞需采用Panning技术，除去CD59^-的阴性细胞，以达到降低突变本底的目的。该过程具体如下：

（1）山羊抗小鼠IgM处理普通平皿：10ml IgM/PBS（20μg/ml）IgM溶于PBS中）加入100mm普通平皿中，使其均匀的覆盖于皿底。室温，静止2小时。PBS清洗2次后，加入5ml1%FBS/PBS(1%小牛胎盘血清溶于PBS)，黑暗中保存于4℃（可过夜）；

（2）A_L细胞收集：处于对数生长期的A_L细胞酶解，悬浮于2%FBS/PBS（2%小牛胎盘血清溶于PBS）中。计数，离心，调整细胞密度至2×10⁶/ml。细胞悬浮于含有0.2%CD59抗体的2%FBS/PBS中，冰浴30分钟。低温离心，预冷的2%FBS/PBS洗涤3次，并将细胞稀释至5×10⁵/ml。

（3）细胞与山羊抗小鼠IgM相互作用：弃去平皿中1%FBS/PBS，将5ml悬浮于2%FBS/PBS中的细胞种植移入平皿。4℃孵育2小时。小心吸出上清夜，用预冷的2%FBS/PBS小心洗涤3次，除去没有贴壁的细胞和CD59^-自发突变细胞。

（4）未突变细胞保存及检测：加入新鲜的F12完全培养液，连续培养3-4天，收集CD59⁺细胞，冻存于液氮。同时，需要对收集的细胞进行突变背景检测，这一过程需要14天。如果突变检测背景仍然偏高，需要重复上述步骤。一般情况下，细胞自发突变背景可降至每10⁵存活细胞中有70-80个突变细胞。由上可见，该方法操作过程繁琐，一个周期通常需要3周时间，特别是用IgM处理平皿和清洗突变细胞过程对实验操作人员技术的熟练程度有一定要求。同时，实验中所使用的特殊抗体—山羊抗小鼠IgM抗体价格较为昂贵，用量大。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种降低野生型人鼠杂交瘤A_L细胞自发突变背景的方法，基于流式细胞分选技术结合特异性荧光抗体，筛选突变及未突变细胞。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤：

（1）野生型细胞收集

收取培养至对数生长期的A_L细胞，酶解消化，悬浮于F12完全培养基中，清洗后制成浓度为±10⁶细胞/100μl的单细胞悬液；

（2）与荧光抗体的结合

加100μl预冷的流式细胞缓冲液重悬细胞后，按配比浓度加入荧光标记的CD59特异性抗体，4℃避光反应30～60分钟后，用预冷的FACS Buffer清洗离心，去除未结合的抗体；

（3）制备上样悬液

重悬细胞于预冷的流式细胞缓冲液后，送入流式细胞分选仪待测；

（4）细胞分选

使用流式细胞分选仪进行分选；

（5）保存

将分选获得的未突变细胞扩增，液氮保存。

所述细胞包括A_L细胞、由该细胞发展的各种缺陷型细胞以及构建的细胞系。