[发明专利]水仙迟季黄化病毒检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种水仙迟季黄化病毒检测试剂盒及其检测方法，属于植物检疫技术领域，适用于进出境及农业生产上水仙迟季黄化病毒的快速检测和监测。

背景技术

水仙迟季黄化病毒（Narcissus late season yellows virus，NLSYV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，该病毒具有和其它马铃薯Y病毒相似的特性，在受感染的水仙细胞内会出现典型的风轮状内含体。病毒基因组为正义单链RNA，全长约9,651bp。水仙迟季黄化病毒（NLSYV）最早在1980年被报道，此后人们对其病毒粒体结构、寄主范围、危害症状、传播方式和血清学特性等进行了相关的研究。NLSYV粒体形态为线条状，大小约750nm×12nm。NLSYV自然寄主较窄，已报道的主要局限于水仙的一些品种。NLSYV侵染水仙后可引起叶片、花茎上出现窄长的褪绿条纹或椭圆状斑块等症状，水仙病株一般不出现畸形、矮化症状。症状大约在花期之后的2-3周出现，随后植株逐渐衰老枯萎，但这种发病症状不一定每年都出现。NLSYV可以通过有翅桃蚜（Myzus persicae）介体在水仙植株间传播。NLSYV在血清学关系上与马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus,TuMV）和六出花花叶病毒（Alstroemeria mosaic virus,AIMV）具有血清学相关性，但与另一同为马铃薯Y病毒属病毒的水仙退化病毒（Narcissus degeneration virus，NDV）没有血清学关系。据报道，NLSYV还能够与其他植物病毒复合侵染水仙，例如虎眼万年青花叶病毒（Ornithogalum mosaic virus,OrMV）、水仙无症状病毒（Narcissus symptomless virus,NSV）。NLSYV侵染水仙后，能够影响水仙商品的品质，造成水仙商品价值不同程度降低。

目前，NLSYV主要分布在英国、荷兰、德国、意大利、以色列、澳大利亚等国家水仙栽培区。由于该病毒可随带病植株及其产品进行远距离传播，因而加强该病毒的检测，对预防该病毒的发生和扩散十分重要。由于NLSYV自然寄主较窄，且常潜伏侵染，利用常规的生物学检测方法进行鉴定，迄今尚未发现有效的鉴别寄主。电子显微镜观察病毒粒体具有直接、准确的优点，但需要昂贵的仪器设备和专门的技术人员，在口岸应用上有较大的局限性。ELISA检测具有特异性强、灵敏度高、操作简单的优点，是目前应用广泛的一种血清学检测技术，该方法不足之处是需要有特异性强、稳定性好的病毒抗体。近年来，随着分子生物学的迅速发展，越来越多的分子生物学技术被应用于植物病毒的诊断鉴定。基于核酸水平的分子生物学检测方法与传统植物病毒检测方法相比，具有检测时间短、灵敏度高和特异性强的突出优点。但到目前为止，关于水仙迟季黄化病毒（NLSYV）分子生物学检测方法的报道甚少，至今尚未见专门应用于该病毒快速检测的巢式RT-PCR技术及分子检测试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种水仙迟季黄化病毒检测试剂盒及其检测方法，克服现有技术中存在的缺陷和不足，能够对进出境及农业生产上水仙迟季黄化病毒进行快速、准确的检疫鉴定。

本发明技术方案如下：

（一）一种用于水仙迟季黄化病毒检测的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

1）外侧上游引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCACTTGAAGTCTATCACCA-3’；

2）外侧下游引物：10μmol/L，引物序列为5’-CCAAACTAGCATCCTTGTGT-3’；

3）内侧上游引物：10μmol/L，引物序列为5’-ATCACATACACACCACGACA-3’；

4）内侧下游引物：10μmol/L，引物序列为5’-GTGTGTCTCTCCGTGTTCTC-3’；

5）RTBuffer：5×；

6）RNA酶抑制因子：40U/μL；

7）反转录酶：200U/μL；

8）dNTPs：10mmol/L；

9）PCR Buffer：10×；

10）Mgcl₂：25mmol/L；

11）Taq DNA聚合酶：5U/μL；

12）水仙迟季黄化病毒的阳性对照样品；

13）不含水仙迟季黄化病毒的阴性对照样品；

14）RNase-free ddH₂O。