[发明专利]胰岛素修饰物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种胰岛素修饰物，其特征在于，包括胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链；

所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素，所述胰岛素B链第30位的丙氨酸被切除，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：

Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH₂)_m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端，m为6～32的整数。

2.一种胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供胰岛素，并使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素，所述胰岛素为猪胰岛素或犬胰岛素；

将结构式为(CH₂)_m(COOH)₂的化合物A溶解在甲醇中，在碱存在的条件下进行皂化反应，接着将产物溶于HCl酸化的庚烷中，重结晶后得到结构式为CH₃OOC(CH₂)_mCOOH的化合物B，其中，m为6～32的整数；

将所述化合物B和足量的具有如下结构式的化合物C溶解在THF中，在催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发除去溶剂，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到固体残余为具有如下结构式的化合物D，

将所述化合物D与足量的谷氨酸-1-甲酯溶解在二甲基甲酰胺中，在所述催化剂存在的条件下，搅拌20h后真空蒸发，残留物溶于乙酸乙酯中并依次用盐酸和水洗涤，接着用硫酸镁干燥，过滤后保留液相并真空干燥，得到的固体残余为具有如下结构式的化合物E，

谷氨酸-1-甲酯

将所述化合物E、足量的具有如下结构式的化合物F和足量的具有如下结构式的化合物G溶解在二氯甲烷中，冰浴冷却条件下搅拌20h，过滤保留液相并真空干燥，得到具有如下结构式的化合物H，

将所述修饰过的胰岛素溶于碳酸钠的水溶液中得到第一溶液，同时将所述化合物H溶于乙腈中得到第二溶液，将所述第一溶液和所述第二溶液混合，30min后用乙醇胺终止反应，向反应体系中加水并调节pH为5.5产生沉淀，保留沉淀并将该沉淀重新溶解后与等体积的0.2mol/L的NaOH溶液混匀进行皂化反应，反应完成后调节pH为5.5，保留沉淀，分离纯化后得到所述胰岛素修饰物，所述胰岛素修饰物包括所述胰岛素以及连接在所述胰岛素B链末端的脂肪酸链，所述脂肪酸链与所述胰岛素B链第29位的赖氨酸如下通式表示：Lys-NH-CO-Glu-NH-CO-(CH₂)_m-COOH，其中，Lys为胰岛素B链第29位的赖氨酸，Glu为连接在所述脂肪酸链末端的谷氨酸，Lys与Glu之间以酰胺键连接，Glu通过酰胺键连接在所述脂肪酸链末端。

3.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，使用羧基肽酶A将所述胰岛素B链第30位的丙氨酸切除，得到修饰过的胰岛素的操作为：

将胰岛素锌盐溶解在水中并用质量浓度为33%的NaOH调节pH为9.3，接着按照所述胰岛素锌盐与EDTA的质量比为100：1加入EDTA，混匀后在室温、搅拌的条件下，按照羧基肽酶A和所述胰岛素锌盐质量比为0.5:100，加入所述羧基肽酶A的悬浮液，15h后加水稀释并用浓醋酸调节pH为3.6，接着加入甲醇和醋酸锌的水溶液，最后用浓氨水调节pH为6.0，过滤后保留沉淀，即为所述修饰过的胰岛素。

4.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，所述得到固体残余为具有如下结构式的化合物D的操作中，所述化合物B和所述化合物C的摩尔比为0.91：1.1，所述催化剂为N,N-二异丙基乙胺，所述催化剂与所述化合物C的摩尔比为1：1；

所述化合物D与所述谷氨酸-1-甲酯的摩尔比为1：1，所述催化剂与所述化合物D的摩尔比为1：1。

5.根据权利要求2所述的胰岛素修饰物的制备方法，其特征在于，所述得到具有如下结构式的化合物H的操作中，所述化合物E、所述化合物F和所述化合物G的摩尔比为1：1：1。