[发明专利]一种新的盐单胞菌及其生产四氢嘧啶的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及微生物领域，具体涉及一种新的盐单胞菌及其突变株在发酵生产四氢嘧啶中的应用。

背景技术：

嗜盐菌属于一种极端微生物，根据其对NaCl的耐受程度可以分为轻度嗜盐菌（最适NaCl浓度为10-30g/L）、中度嗜盐菌（最适NaCl浓度为50-100g/L）和极端嗜盐菌（最适NaCl浓度为130-150g/L）。为了维持细胞内外的渗透压平衡，在嗜盐菌细胞中会积累一些物质以抵抗外界的高渗环境，这类物质主要包括氨基酸及其衍生物、多元醇、糖类以及四氢嘧啶类，其中四氢嘧啶具有重要的应用价值。

四氢嘧啶（1,4,5,6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸，Ectoine）于1985年在极度嗜盐光合细菌（Ectothiorhodospira hlochloris strain DSM 1059）菌株中首次被Galinsk等发现并且鉴定结构，其结构式如下：

四氢嘧啶为一种环状氨基酸，近年来的研究表明四氢嘧啶对体内和体外的酶、DNA和膜等大分子具有稳定作用；能够防止皮肤失水和干燥同时降低紫外线对皮肤的损伤度，另外四氢嘧啶可以抑制类淀粉蛋白的形成，能够降低类淀粉蛋白形成的起始和伸长阶段，因而具有潜在的预防老年痴呆症的功能。

由于四氢嘧啶分子中具有一个手性碳原子，因此很难用化学方法合成，现有的生产方法主要为微生物发酵法。已报道的可产四氢嘧啶的生产菌株中既有革兰氏阳性菌也有革兰氏阴性菌，分布于短杆菌、延长盐单胞菌、海球菌和嗜碱芽孢杆菌等多个科属。国内外已报道的四氢嘧啶生产方法主要有分批发酵、补料分批发酵以及细菌挤奶法。其中细菌挤奶法可通过多次低渗冲击获得比较高的四氢嘧啶产量，但是随着冲击次数的增加四氢嘧啶的产量也随之下降，另外该法对设备和操作的要求较高，因而限制了其应用。中度嗜盐菌的最适生长NaCl浓度和最优合成四氢嘧啶的NaCl浓度相差较大，在较低的盐浓度下生长良好，可以获得较高的生物量，但是单位菌体积累的四氢嘧啶量较少；在较高的盐浓度下生长受到抑制，但单位菌体积累的四氢嘧啶量较大。已报道的较高产量的四氢嘧啶发酵生产过程中均需要高的NaCl浓度来刺激菌体积累更多的产物，而高浓度的NaCl溶液对发酵设备腐蚀严重，不适合大规模的工业化生产，同时高盐的发酵废液对环境造成了较大压力。

发明内容：

本发明提供的盐单胞菌Halomonas sp HS-2255属于中度嗜盐菌，本发明的目的之一是提供了一种可在较低盐浓度刺激下产生较高产量的四氢嘧啶的盐单胞菌（Halomonas sp.）HS-2255，其保藏编号为CGMCC NO.6248。

本发明还保护了盐单胞菌Halomonas sp HS-2255（CGMCC NO.6248）的培养方法，将所述的盐单胞菌（Halomonas sp.）HS-2255（CGMCC No.6248）接种于种子培养基中进行摇床培养，在培养温度为28－35℃的条件下培养至种子液稀释30倍后OD₆₀₀为0.1－1.0，其中种子培养基含有鱼蛋白胨5-20g/L，葡萄糖10-50g/L，酵母膏10-30g/L，NaCl30-50g/L，PH7.5。

另一方面，本发明提供了一种采用盐单胞菌Halomonas sp HS-2255（CGMCC NO.6248）制备四氢嘧啶的方法。该方法包括采用盐单胞菌Halomonas sp HS-2255（CGMCC NO.6248），在含有可同化的碳源、氮源和无机盐的营养培养基里，进行有氧发酵的步骤。其中，所述可同化的碳源选自葡萄糖、糊精、蔗糖、味精、糖蜜、乳酸、甘油、麦芽糊精、麦芽糖中的一种或多种，优选为葡萄糖和味精；可同化的氮源选自酵母抽提物、酵母膏、鱼蛋白胨、味精、氯化铵、硫酸铵，大豆蛋白胨、夫质粉、豆粉、金枪鱼膏、玉米粉、花生饼、棉籽饼中的一种或多种，优选酵母抽提物、酵母膏、鱼蛋白胨、味精、氯化铵或硫酸铵；所述无机盐包括钠盐氯化钠和选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、七水硫酸镁、七水硫酸铁、二水氯化钙、氯化钾、溴化钠、硫酸锰一水合物、硫酸钠、磷酸氢二钠中的一种或多种盐；可优选为氯化钠和选自磷酸氢二钾、七水硫酸镁中的一种或两种盐；其中氯化钠含量优选为30-100g/L，所述发酵培养的温度为25℃-35℃，pH为6.0-9.0，培养时间为12-120小时。