[发明专利]稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞工程技术领域，涉及人大肠癌SW480细胞系的构建，尤其涉及稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系的构建方法。

背景技术

活体生物发光成像是一种新兴的成像技术，其原理是利用发光蛋白如荧光素酶催化光子释放的化学反应，最常用的蛋白是萤火虫荧光素酶，其机制是酶促反应，即荧光素酶在ATP和氧气存在时，催化荧光素酶底物产生氧化反应而发光，因此，这种发光现象必须在活细胞内进行。来自这种反应的光很明显，其散发光谱在400nm至620nm之间，易于被一种CCD相机记录。研究人员可通过荧光素酶标记的细胞、病毒、DNA、基因表达以及动物模型等进行科学研究。利用该成像系统可以直接快速的观察活体内肿瘤的生物学活动。

BALB/c裸鼠属于T细胞免疫功能缺陷动物，且用于活体成像时皮毛产生的自发荧光干扰较少，是建立体内异种移植瘤模型较理想的实验动物。

大肠癌包括结肠癌和直肠癌，是常见恶性肿瘤之一，在我国的发病率居高，手术是目前主要的治疗方法，而术后转移是影响患者预后的重要因素，因此研究大肠癌细胞的生物学活动对于寻找有效的大肠癌治疗方法十分重要。利用免疫缺陷动物建立人类肿瘤动物模型是研究肿瘤体内生长、转移等生物学特性的重要工具。因此对于大肠癌细胞通过荧光素酶标记，在活体成像系统内观察肿瘤发光情况，动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动，对于大肠癌的研究具有十分重要的意义。

发明内容

本发明为了提供一种稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系及其构建方法，以实现在活体成像系统内观察肿瘤发光情况，动态观察肿瘤在活体的生长转移等生物学活动。

本发明是通过以下方案实现的：

上述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，是通过以下方法获得：利用阳离子脂质体将携带有荧光素酶报告基因的质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作，获得稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系。

所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，其中：利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51质粒转染入人大肠癌SW480细胞株。

所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，其中：所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。

上述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系的构建方法，具体包括以下步骤：

首先，G418最佳筛选浓度的确定    

SW480细胞常规培养于含有10%小牛血清的1640培养基；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为l×104/ml，每孔100μl接种于96孔板中，置于细胞培养箱常规培养；在细胞接种24h后，倍比稀释G418，建立0-1mg/mL10个梯度, 加入96孔板中，每种浓度设置6个复孔；每天观察细胞生长情况，在10-14 d内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染SW480细胞的工作浓度；

第二，细胞转染

取对数生长期的SW480细胞，转染前1天将细胞接种于6孔板，24 h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染；转染按照LipofectamineTM2000试剂操作指南进行操作；转染后细胞置于培养箱常规培养；

第三，G418筛选抗性细胞及其单克隆化

质粒转染后48h，细胞1:10传代到24孔板，同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照；细胞贴壁后，加入G418，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液；待对照组细胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆。抗性克隆做荧光素酶活性检测，表达荧光素酶的克隆制备成单细胞悬液，接种于96孔板，待其增殖后转入24孔板扩大培养。重复此单克隆化过程3次，即得到稳定表达荧光素酶的SW480-luc细胞。