[发明专利]稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480细胞系及其构建方法

权利要求书

1.一种稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，是通过以下方法获得：利用阳离子脂质体将携带有荧光素酶报告基因的质粒转染入人大肠癌SW480细胞株；转染后的细胞加入G418，经过3次以上的单克隆化操作，获得稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系。

2.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，其特征在于：利用阳离子脂质体将携带荧光素酶报告基因和新霉素抗性基因的PGL4.51质粒转染入人大肠癌SW480细胞株。

3.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系，其特征在于：所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。

4.如权利要求1所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系的构建方法，具体包括以下步骤：

首先，G418最佳筛选浓度的确定    

SW480细胞常规培养于含有10%小牛血清的1640培养基；取对数生长期细胞，调整细胞浓度为l×10⁴/ml，每孔100μl接种于96孔板中，置于细胞培养箱常规培养；在细胞接种24h后，倍比稀释G418，建立0-1mg/mL10个梯度, 加入96孔板中，每种浓度设置6个复孔；每天观察细胞生长情况，在10-14 d内使细胞全部死亡的最低G418浓度，即为筛选转染SW480细胞的工作浓度；

第二，细胞转染

取对数生长期的SW480细胞，转染前1天将细胞接种于6孔板，24 h内待细胞融合度达到70%-90%即可转染；转染按照LipofectamineTM2000试剂操作指南进行操作；转染后细胞置于培养箱常规培养；

第三，G418筛选抗性细胞及其单克隆化

质粒转染后48h，细胞1:10传代到24孔板，同时以相同的密度传代未转染的细胞作为对照；细胞贴壁后，加入G418，根据细胞死亡情况和培养基的营养状况及时换液；待对照组细胞全部死亡后，即得到初步抗性克隆；抗性克隆做荧光素酶活性检测，表达荧光素酶的克隆制备成单细胞悬液，接种于96孔板，待其增殖后转入24孔板扩大培养；重复此单克隆化过程3次，即得到稳定表达荧光素酶的SW480-luc细胞。

5.如权利要求4所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系的构建方法，还包括荧光素酶活性鉴定，具体鉴定方法为：

SW480-luc细胞浓度分别为5.0×105/ml、2.5×105/ml、1.25×105/ml、0.625×105/ml、0.313×105/ml和0.156×105/ml，每孔100μl加入96孔白板中，每组设3个复孔；每孔加0.5μl30mg/ml的荧光素底物，37℃孵育10min，荧光照度计测荧光值；比较各克隆的荧光强度，并分析荧光强度与细胞数之间的相关性。

6.如权利要求4或5所述的稳定表达荧光素酶的人大肠癌SW480-luc细胞系的构建方法，其特征在于：所述G418对SW480细胞株的最佳工作浓度为700ug/ml。