[发明专利]黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法

说明书

一、技术领域

本发明公开了利用荧光原位杂交技术直接将黄瓜单拷贝基因在染色体上进行物理定位的方法，有利于开展黄瓜的细胞遗传学研究，属于植物生物技术领域。

二、技术背景

黄瓜(Cucumis sativus L.，2n＝14)是世界上最重要的蔬菜作物之一。黄瓜具有一些特殊的性状，如性别表型多样化、线粒体的父性遗传性等；同时黄瓜的基因组相对较小(约370Mb)，染色体数目少，仅为14条，使得黄瓜成为近年来分子细胞遗传学研究的模式物种之一。

细胞遗传图谱是指遗传上标记的探针在染色体上的位置，涉及了细胞学上的标志，例如着丝粒、端粒、异染色质区和核仁组织区等。伴随着基因组研究的进步，细胞遗传图谱不仅对于整合遗传、分子和细胞学的信息具有重要的价值，并且能为染色体水平上观察基因组结构提供一种独特的研究思路。

基因或特定序列的染色体物理定位是细胞遗传相关研究的重要内容之一。传统的FISH技术对目标片段长度有一定的要求，一般片段至少在10kb以上才能检测到可见的信号。目前基因染色体物理定位的主要方法是利用包含该基因的大片段克隆进行染色体荧光原位杂交，从而进行相应基因的物理定位，这些大片段克隆主要有BAC、Fosmid等。该方法依赖于大片段文库的构建、以及利用相应的分子标记筛选获得特写的克隆，才能用于基因的物理定位。

构建细胞遗传图谱最直接、最有效的方式是通过FISH直接将单拷贝基因定位到染色体上，多数基因的长度在10kb以下，这对FISH的检测精度提出了新的挑战。在植物染色体上，短片段序列的检测更为很难，主要是由于植物细胞壁碎片和浓厚的细胞质不易去除，背景较高，同时阻止了靶DNA的顺利进入，最终导致了相对低的信噪比。迄今，单拷贝基因的FISH检测仅来自于少数几个实验室的报道。例如Fransz等人(1996年)在矮牵牛的有丝分裂中期染色体上用1.4kb大小的探针定位了查耳酮合酶基因A；Ohmido等人(1998年)在水稻有丝分裂中期染色体上定位了一个1.29kb大小的序列；Wang(2006)等在玉米粗线期染色体上能检测到3kb的基因信号。然而，由于技术上的难度，单拷贝基因的染色体物理定位在植物中仍未见广泛的应用。

目前，单拷贝基因在黄瓜中期和粗线期染色体上的定位仍未见报道，我们通过改进制片技术，并利用纯化的单拷贝基因进行FISH检测，能在染色体上看到明显的单拷贝基因的信号，最小能检测到2Kb的基因片段，从而实现了单拷贝基因在染色体上的直接物理定位。

三、发明内容

技术问题

本发明黄瓜单拷贝基因在染色体上的物理定位方法的目的，是针对以往黄瓜单拷贝基因无法在黄瓜染色体上进行直接定位等缺陷，发明能通过FISH在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到小至2kb长度的单拷贝基因的信号，为制作高分辨率的黄瓜染色体的物理图谱奠定了基础，加快了黄瓜的细胞遗传学研究进展。

技术方案

本发明所提供的黄瓜单拷贝基因在染色体上的物理定位，其特征在于：在黄瓜中期和粗线期染色体上观察到了清晰明显的且片段小至2kb的单拷贝基因探针的信号。

上述黄瓜单拷贝基因能够定位在染色体上，是通过以下方法获得的：

取黄瓜植株根尖以及盛花前期和盛花期大小的花蕾，分别用固定液固定备用。

取出固定好的根尖和花蕾，处理之后酶解，然后用涂片法制片，镜检，进一步用胃蛋白酶进行细胞质的去除，然后用乙醇梯度干燥，备用。

根据黄瓜基因组数据库，随机选择黄瓜单拷贝基因，利用Primer5.0设计引物，利用长片段Taq酶进行PCR扩增，扩增产物在1％的琼脂糖凝胶中电泳，然后进行切胶回收。

将得到的回收产物作为DNA模版，再进行二次PCR扩增。

将二次PCR产物标成探针备用，通过FISH，将探针杂交到黄瓜染色体上，在荧光显微镜下观察信号。

有益效果

本发明与现有技术相比，具有如下优点和积极效果：

1)黄瓜单拷贝基因通过FISH能够在黄瓜中期和粗线期染色体检测到信号(图1和2)，且检测到的探针信号的最小片段小于2kb(图4)，与现有技术相比，充分提高了靶信号的灵敏度。

2)现有的技术在定位目标基因时，主要利用大片段文库进行FISH定位，这需要事先构建好相应的文库，需要特定的条件。同时还需要在文库中筛选获得包含目标基因的克隆，程序相当繁琐。而使用现在的方法可以直接进行基因的定位，检测到的最小探针长度为2kb，适合于绝大多数基因的定位需要。