[发明专利]一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用

说明书

技术领域    

本发明涉及一种人属微小RNA，具体涉及一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。

背景技术

头颈鳞癌为全世界第六位高发肿瘤，位居欧洲男性高发肿瘤的第4位，而喉鳞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）源于喉黏膜上皮，发病率居头颈鳞癌的第2位。据统计，目前全世界范围内喉鳞癌发病略有上升，且年轻化趋势逐渐显现。 

喉解剖结构局限且黏膜下淋巴管丰富，因此喉鳞癌具有局部侵袭及颈淋巴结转移的恶性生物学特性，成为患者治疗后复发及预后不良的重要风险因素，这也是近30年来喉鳞癌5年生存率并未有明显提升的一个重要因素。在喉鳞癌侵袭转移的过程中势必伴有一些抑癌基因和/或癌基因的异常表达，如抑癌基因的下调表达，癌基因的上调表达。因此探索这些与喉鳞癌侵袭转移相关的基因表达紊乱的分子生物学机制着重要的临床意义。 

microRNAs（miRNAs）是目前新发现的一类长度约为22nt的内源性非蛋白编码单链小分子RNA，广泛存在于真核生物中，它能够与其相应靶基因信使RNA（mRNA）的3’端非翻译区（3’-UTR区）结合，从而降解mRNA或抑制其翻译。研究表明miRNAs与肿瘤关系密切，充当癌基因或抑癌基因的角色，在肿瘤细胞生长、增殖、分化、凋亡、恶性间质转化、干细胞分化等方面发挥重要作用。 

目前发现人类基因组编码多达2000多种不同的miRNAs，miRNA调控基因组约30%编码基因的表达。研究显示约50%的miRNA位于肿瘤相关的基因组区域或脆性位点，且不同类型肿瘤中miRNA表达谱存在较大差异。一些miRNA在恶性肿瘤中表达上调，这类miRNAs能通过抑制肿瘤抑制基因或控制细胞周期进程、分化或凋亡的基因，刺激细胞增殖及血管生成，促进肿瘤发生，这类miRNAs具有癌基因的作用，因此被称为致癌性miRNA。与致癌性miRNA相反，在恶性肿瘤中表达下调的一些miRNAs可能通过负向调控癌基因和/或负向调控抑制细胞分化或凋亡的基因发挥抑癌基因的作用，称为抑癌性miRNA。 

越来越多的研究表明，具有致癌或抑癌作用的miRNA分子参与了包括肝癌、肺癌、乳腺癌、结肠癌、脑肿瘤及白血病在内的多种肿瘤的发生、发展。迄今，miRNA的功能与癌症形成的相关性研究已成为国内外的热点方向。目前在喉鳞癌的研究中，涉及miRNAs报道或相关研究极少。 

发明人通过microRNA芯片（Agilent human 8*15k miRNA V12.0）检测了多名喉鳞癌患者及同患者癌旁正常黏膜切缘蜡包埋组织中差异表达的microRNA分子，发现Hsa-miR-145-5p在喉鳞癌组织中比癌旁正常黏膜组织中下调了约2.74倍，这说明Hsa-miR-145-5p可能在喉鳞癌中充当抑癌基因的角色，发明人进一步通过生物信息学预测及双荧光报告载体系统，结合喉鳞癌侵袭转移的特点，描锭并验证了FSCN1是Hsa-miR-145-5p直接调控靶基因。 

发明目的

本发明的目的是提供一种Hsa-miR-145-5p试剂盒及其成熟体模拟物的应用。

本发明是以Hsa-miR-145-5p的前体序列hsa-mir-145 MI0000461为SEQ ID No:1：CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGUU，为基础进行的发明。 

本发明提供了一种Hsa-miR-145-5p试剂盒，是由以下组合试剂构成的： 

Hsa-miR-145-5p 基因定量检测组分：包括Hsa-miR-145-5p PCR引物，10mM浓度的dNTP，RNase抑制剂，microRNA/cDNA逆转录引物，5倍浓度的buffer液，M-MLV，2倍浓度的SYBR Green PCR Master Mix混合液及去离子水；

Hsa-miR-145-5p荧光原位杂交探针：为与Hsa-miR-145-5p碱基互补的碱基序列，并采用DNA骨架修饰，同时用荧光基团cy3修饰；

FSCN1免疫组化组分：包括鼠抗人FSCN1单克隆抗体，镶嵌过氧化物酶基团的羊抗鼠二抗，山羊非免疫血清，100倍浓度的PBS及1‰ 吐温20混合液，DAB显色色原、底物及缓冲液。

上述的试剂盒在喉鳞癌预后评估中的应用，优选地针对喉鳞癌石蜡包埋样本。