[发明专利]雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学研究领域，涉及一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，是应用多种细胞因子（TGF-β1/IL-15/IL-2）联合大环内酯类免疫抑制药物——雷帕霉素协同诱导调节性γδT细胞的生成和扩增。 

背景技术

γδT细胞是T淋巴细胞中的一群特殊的细胞亚群，其有独特的结构和生物学功能。与一般的αβT细胞不同，γδT细胞表面受体由γ链和δ链两种糖蛋白链组成，因此而命名；这群细胞识别抗原不需要经细胞表面组织相容性抗原分子提呈，它可直接识别蛋白质、肽类和非肽类抗原，即该过程为非HLA（人类白细胞抗原）限制性，是γδT细胞的一个重要生物学特性。尽管γδT细胞在外周血和淋巴器官中比例非常小，但是其在人体特异性和非特异性免疫系统中均起着非常重要的作用，不但能够防御病原体包括细菌、真菌、病毒和寄生虫的侵染，而且在肿瘤的免疫监视、维持组织自身稳态、炎症反应和炎症后期组织的修复上均发挥重要作用。近几年研究发现，γδT细胞在不同的微环境诱导下可分为不同的亚群，包括γδTh17、γδTh1和调节性γδT细胞（γδTreg）等。 

γδTreg是γδT细胞中的一群特殊的细胞亚群，它与一般的调节性αβT细胞一样均表达Foxp3转录因子，其免疫表型以TCRγδ+Foxp3+双阳性为特征（TCR指细胞表面受体）。已有的研究显示该群细胞具有强大的免疫抑制功能，Xiaoyan Li等人研究发现γδTreg在抑制和缓解系统性红斑狼疮SLE中发挥很重要的调控作用；随后Jian Ye等人的研究显示乳腺肿瘤来源的γδTreg细胞可通过免疫衰老的机制发挥对机体特异和非特异性免疫的抑制作用；在我们之前的研究中，我们利用人源化NOD/SCID小鼠首次发现了γδTreg对异基因造血干细胞移植后的移植物抗宿主病（GVHD）所具有的免疫防护作用，即γδTreg的共输注可以一定程度上缓解GVHD的发生。γδTreg细胞已表现出来的重要的免疫负调控作用提示其具有潜在的治疗自身免疫性疾病、实体器官移植排斥反应和异基因造血干细胞移植后移植物抗宿主病的作用，并且γδT细胞本身识别抗原的非HLA限制性特征，增加了这群细胞所具有的研究价值和临床应用前景。然而目前对γδTreg的体外诱导扩增方法偏少，因此找到一种新的γδTreg体外诱导培养方法，提高其体外诱导扩增效率，对以后γδTreg的进一步研究及其临床应用均具有很重要的意义。 

发明内容

本发明的主要目的是提供一种雷帕霉素诱导调节性γδT细胞的培养方法，其主要步骤如下： 

（1）人外周血单个核细胞制备：取外周血标本，肝素抗凝，应用人淋巴细胞分离液分离制备单个核细胞，用含10%胎牛血清的完全RPMI1640培养液重悬细胞；

（2）调节性γδT细胞诱导扩增：细胞接种当日按第0天计算，第0天加入唑来膦酸激活γδT细胞，同时加入IL-2/IL-15/TGF-β1和雷帕霉素培养诱导，在第3、6、9天分别进行半量换液，每次换液时均加入新鲜IL-2/IL-15/TGF-β1和雷帕霉素，浓度同前，于第15天检测培养细胞中调节性γδT细胞的含量；

（3）调节性γδT细胞含量的检测：采用流式细胞术，以γδTCR和Foxp3作为分子标记，γδTCR+为γδT细胞的表型特征，γδTCR+Foxp3+为调节性γδT细胞的表型特征，检测调节性γδT细胞在培养细胞中所占的比例；

（4）调节性γδT细胞的富集：采用免疫磁珠分选方法（MACS）分选γδTCR+细胞群，内包含调节性γδT细胞；

（5）检测富集的调节性γδT细胞的免疫抑制功能：采用流式细胞术，通过CFSE细胞共培养试验检测分析诱导的调节性γδT细胞对新鲜外周血来源单个核细胞的增殖抑制作用。

本发明的另一个目的是所述的培养方法在调节性γδT细胞培养中的应用，所述培养通过雷帕霉素诱导实现。 

为进一步深入研究调节性γδT细胞的生物学特性及其以后的临床应用提供基础，本发明利用多种细胞因子（包括唑来膦酸、IL-2、IL-15和TGF-β1）联合大环内酯类免疫抑制剂——雷帕霉素，将人外周血来源的单个核细胞通过体外诱导扩增，培养出大量的调节性γδT细胞。本发明整个诱导、扩增和富集过程简单，可行性强；细胞培养周期短，成本低；诱导效率高，重复性好；诱导的调节性γδT细胞活力好，具有较强的免疫抑制功能，能保证以后的进一步研究，具有很好的推广价值。 

附图说明