[发明专利]提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法

说明书

技术领域

本发明属于家畜胚胎工程技术领域，具体涉及一种能通过添加生物活性物质提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法。

背景技术

目前牛的冷冻精液已经进入商业化生产，而且被广泛应用于人工受精技术。但是，精液生产和使用中的冷冻解冻过程破坏了精子的活性氧(reactive oxygen species，ROS)在正常生理条件下的动态平衡状态，导致精子ROS增加，引起精子膜的过氧化和DNA损伤，从而影响精子活力、质膜完整性及受精潜力等，降低了精液品质。

谷胱甘肽(GSH)是哺乳动物细胞中重要的非蛋白硫氢化合物，它作为过氧化—还原酶系统的作用物之一，能及时保护精子免遭氧化及过氧化反应终结产物的伤害，使精子脂膜结构保持稳定。人类和其它哺乳动物包括牛、猪的精子经过冷冻和解冻处理后，细胞中GSH的含量显著下降，精子的运动性和生存能力也因此而显著降低。Gadea等（2011）报道指出，在人类精液冷冻液中添加1mmol/L谷胱甘肽，能提高总体精子活率，同时能改变精子直线运动速度、平均路径速度和运动的摆动性。在解冻液中添加1mmol/L或者5mmol/L的谷胱甘肽，能提高总体精子活率和直线运动的精子活率。张文举等（1997）在牛稀释精液中添加3mmol/L的谷胱甘肽，明显提高了公牛的冻精活力，顶体完整率，并且使母牛情期受胎率提高了6.4％；Saweta等（1995）向牛冷冻稀释液中添加5mmol/L的谷胱甘肽，冷冻3.0h后解冻，发现精子活力比未添加谷胱甘肽的精子活力提高了6.4％，精子的顶体完整率提高了3-8％，受胎率提高了6.3％；刘璐等(2010)在常规冷冻稀释液中添加5mmol/L谷胱甘肽解冻后，精子活力、顶体完整率均优于对照组，畸形率低于对照组；但是浓度高于5mmol/L时，精液活力有所下降。

咖啡因作为环状核苷酸酯酶的一种抑制剂，主要通过抑制环腺苷酸酶来使细胞内积累充分的cAMP，使精子内与精子运动、获能、顶体反应相关的环状磷酸腺苷(cAMP)含量增高。能在ATP酶活性低的情况下维持精子活力，从而增强精子活动能力。大量的研究表明，添加不同浓度的咖啡因对精子活动能力的影响不同。牛原精液在含6mmol/L咖啡因的基质中，37℃培养4h，精子活率为55.2%，显著高于对照组（27.2%）（Garbers et al.,1971）。咖啡因的浓度为60mmol/L时，人精子的总活率、运动速度、直线运动的精子活率和运行速度都被抑制，浓度达到120mmol/L时，精子完全停止运动（Moμssa，1983）。同时Garbers等（1971）的研究还发现，咖啡因对不同公牛个体精子的作用不同，咖啡因可以迅速激活低活率个体的精子，但是对于高活率个体精子的刺激作用不明显。文国艺(2000）报道指出，咖啡因在提高精子活率促进精子获能的同时，对卵母细胞和早期胚胎有毒害作用并最终影响胚胎质量，并且毒性作用随浓度的增加和时间的延长而增强。因此，咖啡因的添加浓度以及与其它物质是否可以协同使用减少其毒害作用有待于我们的进一步研究。

在精液的稀释和冷冻过程中单独添加谷胱甘肽和咖啡因这两种精子活性物质能改善精子运动能力的报道较多，由于这两种物质对精子的作用机制不同，两者是否存在协同作用以及合适浓度的组合都尚未见报道。但是在精子代谢的过程中，谷胱甘肽和咖啡因有共同作用的位点（Ferrero JL,Neims AH.1983;Hong et al.,1984），这为两种物质的联合应用提供了可能。尽管通过分析精子的运动能力可以预测精子的受精能力，但是要全面评价谷胱甘肽和咖啡因这两种活性物质对体外受精后胚胎的发育情况的影响，仍然需要体外受精试验的进一步验证。

以下是申请人检索的相关资料：

1、Gadea J,Molla M,Selles E,Marco MA,Garcia-Vazqμez FA,Gardon JC.Redμced glμtathione content in hμman sperm is decreased after cryopreservation:Effect of the addition of redμced glμtathione to the freezing and thawing extenders.Cryobiology.2011;62:40-6。

2、张文举，杨军祥，黄全成，等.谷胱甘肽提高牛冻精活力及受胎率的研究．甘肃畜牧兽医，1997(2)：13。

3、刘璐，张劭俣，张彧，等.犬常规冷冻稀释液中添加谷胱甘肽的研究.北京农业.2010,12:1-9