[发明专利]提高牛冷冻精液精子运动性和体外受精率的方法

权利要求书

1.一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，依次包括牛冷冻精液的前期处理、受精前精液的获能处理和与加入卵母细胞的受精滴进行体外受精三个阶段，其特征在于：在牛冷冻精液的前期处理阶段中用SP-TALP洗涤液对牛精液处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在受精前精液的获能处理阶段中使用PHE获能液对牛精液进行获能处理时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，或在体外受精阶段中制备含有卵母细胞的受精滴时加入纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因；其中，在牛冷冻精液的前期处理阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中浓度均为5mmol/L；在受精前精液的获能处理阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有牛精液的IVF-TALP受精液和PHE获能液的混合液中浓度均为5mmol/L，在体外受精阶段，每支牛冷冻精液加入谷胱甘肽和咖啡因的量为：两者在含有卵母细胞的受精滴与牛精液混合液中的终浓度均为5mmol/L。 

2.根据权利要求1所述的一种提高牛冷冻精液精子运动性及体外受精率的方法，其特征在于在牛冷冻精液的前期处理阶段加入谷胱甘肽和咖啡因时，其体外受精的具体步骤如下： 

（1）取一支牛冷冻精液，将其解冻后收集至离心管中第一次离心并弃上清液，然后按照1:1的体积比加入SP-TALP洗涤液混合均匀，并向牛精液和SP-TALP洗涤液的混合液中添加纯度均大于98%的谷胱甘肽和咖啡因，致使谷胱甘肽和咖啡因在含有牛精液的SP-TALP洗涤液中的浓度均为5mmol/L，然后放入37℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中温育2-3小时；其中第一次离心的离心速度为1500-2000r/min，离心时间5-8min； 

（2）将步骤（1）中温育处理后的混合液放入离心管中第二次离心并弃上清液，然后向留取的牛精液沉淀混合物中加入IVF-TALP受精液调整精子的浓度为3×10⁶个/mL～4×10⁶个/mL，之后放入37℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中储存备用；其中第二次离心的离心速度为1500-1700r/min，离心时间为5-10min，二次离心弃上清后留取的牛精液沉淀混合物为100-120μL； 

（3）将步骤（2）中准备的含有精子的IVF-TALP受精液与PHE获能液按照17:13的比例混合后形成含有牛精液的混合获能液，放入37℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中备用； 

（4）取40-50μL的IVF-TALP受精液，加入5-6枚经体外培养成熟的牛卵母细胞，制备成60μL含有牛卵母细胞的受精滴，并放入温度为38.5℃，5%CO₂和100%饱和蒸汽培养箱备用； 

（5）将步骤（4）中制备的含有牛卵母细胞的受精滴与步骤（3）中获能处理后的含有牛精液的混合获能液按照体积比1:1的比例混合后放入38.5℃，5%的CO₂和100%饱和蒸汽的培养箱中培养18-20h。